百會(huì)透懸厘針刺對腦出血模型大鼠腦組織NGF蛋白表達(dá)的影響*

李雪巖，李德韜，付洪瑜，牛霏霏，孔 瑩△，孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.大慶油田總醫(yī)院腦血管醫(yī)院，黑龍江大慶163000;3.黑龍江省康復(fù)醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150018;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院，河北廊坊065001;5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

在臨床上應(yīng)用百會(huì)透懸厘針刺治療腦出血患者，收到較好療效，針刺可以激活腦細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化，而真正起作用的是神經(jīng)生長因子(NGF)，它有維持交感神經(jīng)的細(xì)胞的存在的作用，軸突的生長方向也需要它的參與，無論周圍神經(jīng)還是中樞神經(jīng)的修復(fù)也是離不開它的參與。作用機(jī)理是使Ca2+水平在細(xì)胞內(nèi)保持穩(wěn)定，使興奮性氨基酸的毒性得到有效的拮抗，另外能起到抗自由基的作用。現(xiàn)在對腦出血的治療已從單純內(nèi)科治療轉(zhuǎn)為針對腦出血病理生理機(jī)制的治療，少針透刺是導(dǎo)師多年臨床經(jīng)驗(yàn)的心得。為了提供有效地理論支持，開辟新的治療途徑，特進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級雄性Wistar大鼠，總重量(280±10)克，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

①307－6型臺(tái)式牙鉆機(jī)(中國上海齒科醫(yī)械廠);②立體定位儀ZH－藍(lán)星B型(中國安徽儀器廠);③生物組織包埋機(jī)KH－BL(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司);④微量注射器;⑤石蠟切片機(jī)LEICA RM 2135石(中國天津航空機(jī)電公司);⑥自動(dòng)脫水機(jī)XGQ－15/20(泰州世紀(jì)康峰機(jī)電制造有限公司);⑦展片機(jī)TEC－2601型(常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司);⑧烤片機(jī)PPTHK－21B(上海精密儀器儀表有限公司);⑨恒溫低溫冰箱;⑩電熱恒溫箱;?電子天平FA1004N(鄭州時(shí)代儀器設(shè)備有限公司);?病理圖像分析系統(tǒng)JD801(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司);?數(shù)碼相機(jī)(日本);?Motic image 3.2 圖像分析軟件(Motic公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

①PV－6001二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物有限);②NGF免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司);③DAB顯色試劑盒(天津百浩生物科技有限公司);④多聚賴氨酸(廣州市一科生物有限公司);⑤Na2HPO4·12H2O，分析純(北京康普匯維科技有限公司);⑥多聚甲醛，分析純(北京康普匯維科技有限公司);⑦NaCl，分析純(廣州市一科生物有限公司);⑧NaH2PO4·2H2O，分析純(北京康普匯維科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將80只健康雄性大鼠隨機(jī)取8只作為對照組，剩余72只造模成功后隨機(jī)分為模型組、藥物組、針刺組。藥物組與針刺于造模成功6 h后，給予相應(yīng)的藥物與針刺治療，然后在對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)停止治療并取材。

對照組(A):8只，不做手術(shù)處理，斷頭取材。

模型組(B):24只，分為2天、7天、14天時(shí)間點(diǎn)，每點(diǎn)8只大鼠，造模后2天、7天、14天分別取材。

藥物組(C):24只，分為2天、7天、14天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每點(diǎn)8只大鼠。造模成功6 h后，給予腦活素稀釋液灌胃(按人:大鼠體重為200∶1配置)。2天組連續(xù)灌胃2天，1 ml每天1次;7天、14天同上，然后分別取材。

針刺組(D):24只，分為2天、7天、14天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每點(diǎn)8只大鼠，造模成功6 h后，給予針刺治療，1次/天。針刺病灶側(cè)百會(huì)穴透懸厘穴，取穴方法參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)1次，每次1 min，以200轉(zhuǎn)/min速度捻針。針刺治療后于2天、7天、14天分別取材。

1.5 腦出血模型的制備

根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)尾殼核位置。采用腦內(nèi)定向注射膠原酶誘發(fā)大鼠ICH模型。將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，使上門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm，這樣大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取頭皮正中，備皮消毒，正中切口，長度約1 cm，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取前內(nèi)點(diǎn)(Bregma)右旁開3.5 mm、后0.2 mm定點(diǎn)，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔垂直進(jìn)針約6 mm，用自動(dòng)推進(jìn)器按每只 0.8 U(0.1 U/μL)膠原酶Ⅶ，以 1 μL/min的速度緩慢勻速注入右側(cè)尾狀核，緩慢出針?？p合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒，防止局部感染影響指標(biāo)觀察。

1.6 標(biāo)本取材

麻醉，暴露取材心臟，必須左心室插管最后抵達(dá)升主動(dòng)脈根部，于右心耳剪0.2 cm口做出口。將9%氯化鈉200 ml灌注，等到流出的變清澈，換100 ml的4%多聚甲醛灌注，等到標(biāo)本變硬。斷頭取腦，冠狀切片，厚度約5 mm部分標(biāo)本將其放入含有千分之一的DEPC的4%多聚甲醛1/0.1MPBS固定液中固定，然后按常規(guī)脫水、浸蠟、包埋制成厚度5 um的石蠟切片用于HE染色，NGF免疫組化檢測。

1.7 NGF免疫組織化學(xué)檢測

①切片脫蠟;②放在30%H202溶液中孵育8 min，PBS洗5 min3次;③熱抗原修復(fù):將切片浸入0.01 mol/L，PH6.0構(gòu)椽酸鹽緩沖液中，加熱至95℃30 min，室溫冷卻30 min，PBS洗5 min;④滴加正常山羊血清封閉液30℃孵育30 min;⑤滴加一抗40℃孵育過夜;PBS洗5 min3次;⑥滴加入生物素化二抗工作液37℃孵育30 min，PBS洗5 min 3次;⑦DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，取1 ml蒸餾水，加試劑盒中試劑各l滴，均勻后加至切片，室溫撇色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在8 min左右蒸餾水洗滌;⑧蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀測。

1.8 NGF陽性細(xì)胞表現(xiàn)

血腫周圍腦組織中:在顯微鏡下觀測，DAB顯色陽性細(xì)胞呈淡棕黃色或淡褐色，利用Motic image 3.2圖像采集系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析，在Motic－BA400倍顯微鏡視野下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各實(shí)驗(yàn)組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著差異，以P＜0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織中NGF檢測的陽性細(xì)胞數(shù)比較

由表1可見，A組與B組比較均有意義。造模后2天，D組與B組比較有顯著性差異(P＜0.01)，D組和C組兩者結(jié)果有差異(P＜0.05)。造模后7天、14天C組與 B組比較，NGF陽性細(xì)胞數(shù)增高(P＜0.05)，D組與B組相比，NGF陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高(P＜0.01)D組和C組兩者結(jié)果有差異(P＜0.05)。

表1 各組大鼠NGF陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表1 各組大鼠NGF陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

注:與A 組比較，*P ＜0.05;與B 組比較，▲P ＜0.05，△P ＜0.01;與C組比較，●P＜0.05。

組別 n 2天 7天 14天空白組8 656.50 ±4.29 656.51 ±4.28 656.49 ±4.29模型組 24 700.30 ±4.01* 722.01 ±7.65* 741.50 ±8.51*西藥組 24 801.25 ±6.51 840.31 ±6.51 862.01 ±6.78▲針刺組 24 858.83 ±3.16△● 912.03 ±3.50△● 986.96 ±3.51△●

2.2 大鼠腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值比較

由表2可見，針刺組及西藥組周圍腦組織中NGF陽性細(xì)胞平均光密度值，隨不同的時(shí)相點(diǎn)變化而逐漸增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。針刺組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 大鼠不同時(shí)相點(diǎn)周圍腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值的比較(±s)

表2 大鼠不同時(shí)相點(diǎn)周圍腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值的比較(±s)

注:與 B 組比較，*P ＜0.01;與 C 組比較，△P ＜0.01。

組別 n 2天 7天 14天空白組8 0.31 ±0.01 0.31 ±0.004 0.31 ±0.004模型組 24 0.31 ±0.01 0.33 ±0.004 0.35 ±0.004西藥組 24 0.40 ±0.01* 0.42 ±0.01* 0.45 ±0.01*針刺組 24 0.48 ±0.01＊△ 0.52 ±0.004＊△ 0.58 ±0.004＊△

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對比研究表明:針刺治療效果優(yōu)于藥物治療組，而對于主要調(diào)控機(jī)理也是本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容。目前很多基礎(chǔ)研究證明氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)參與了腦出血的過程并使之加重，這一過程在很多的顱腦損傷中已經(jīng)被證實(shí)［1－2］。本實(shí)驗(yàn)通過頭穴透刺提高了NGF的表達(dá)，而NGF可以提高損傷皮層內(nèi)的神經(jīng)元中超氧化物歧化酶以及谷膚甘膚還原酶的活性，因此，NGF有著重要的意義，在神經(jīng)修復(fù)這一復(fù)雜過程中起到了決定性的作用。

另一方面，本實(shí)驗(yàn)中給予腦活素治療也提高了NGF的表達(dá)，這說明營養(yǎng)腦細(xì)胞的藥物對于治療腦出血也有效，查閱相關(guān)文獻(xiàn)也提供了相似的結(jié)論，如王艷輝等［3］通過使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，然后給予低劑量的可控制的來源于外部的NGF，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)論:濃度為100 ug/L的NGF可以有效的緩解與興奮性氨基酸毒性引起的腦細(xì)胞凋亡。此外蔡晶等［4］通過藥物干預(yù)對因血管病變而導(dǎo)致癡呆的模型大鼠皮質(zhì)相關(guān)區(qū)域神經(jīng)生長因子表達(dá)研究，觀察神經(jīng)細(xì)胞微結(jié)構(gòu)、傳遞信息的突觸使者數(shù)密度、NGF有效陽性指標(biāo)的神經(jīng)元光密度值等一系列手段證明:藥物可以提高NGF表達(dá)，可以有效的促進(jìn)皮層相關(guān)神經(jīng)元中NGF的含量，能夠改善腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞的損傷。而刁士元［5］采用了新的模型建立方法，提高了造模的成功率，使顳葉缺血病灶更準(zhǔn)確，成功的建立了再灌注模型，然后給予一定量的來自自體以外的NGF，目的是觀察這一方法是否有效，通過一系列的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自外部的NGF有效地抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)也降低了細(xì)胞的損傷，對已經(jīng)受損的神經(jīng)元細(xì)胞起到有效的修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)證明透刺可以減少腦細(xì)胞的死亡、修復(fù)神經(jīng)，而其內(nèi)在調(diào)控因子較多，NGF為其中之一。此外，也有學(xué)者提出NGF對腦細(xì)胞有修復(fù)作用，如石秋艷等［6］及鄒偉等［7］對腦組織內(nèi)的NGF以及相關(guān)因子的研究指出:在未手術(shù)組見少量陽性細(xì)胞出現(xiàn)，而腦出血組隨著時(shí)間的推移而增長，說明NGF對腦細(xì)胞是有修復(fù)作用的。無論是外源性還是內(nèi)源性的NGF都對神經(jīng)元細(xì)胞存在修復(fù)作用，同時(shí)它對軸突生長的方向，也起著重要的作用。而導(dǎo)師在臨床用本法治療腦出血患者，收到較好療效，故通過本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)。針刺治療中風(fēng)病歷史悠久，在臨床實(shí)踐中更是效果突出。腦出血后通過少針透刺治療是未來的趨勢，有待為本療法提供更多的臨床和基礎(chǔ)研究依據(jù)。

通過本實(shí)驗(yàn)說明“百會(huì)透懸厘”針刺法能促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù);并修復(fù)在急性期腦出血中受損的細(xì)胞。

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［7］鄒偉，劉芳，孫曉偉，等.頭針對急性腦出血大鼠BDNF和NGF表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010(6):13