RT-PCR檢測人膀胱上皮細(xì)胞雙功能氧化酶表達(dá)＊

耿會珍 劉明巖 趙麗君 劉珍 劉燕翔 黃寧 王伯瑤 吳琦

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫研究室,四川 成都 610041)

吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶被激活后,細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā),產(chǎn)生大量活性氧(ROS),成為細(xì)胞殺滅微生物的重要成分。2000年以后,在非吞噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了NADPH氧化酶的同源物家族,被命名為 NOX(NADPH oxidase)家族。人類 NOX家族共有 7 個成員,即 NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox-1和Duox-2[1-3]。NOX家族廣泛表達(dá)于機(jī)體的組織器官,其生物學(xué)功能成為研究的熱點(diǎn)。雙功能氧化酶(Duox-1和Duox-2)最初在甲狀腺中發(fā)現(xiàn),它們除了具有NOX的C端結(jié)構(gòu)域外,還有一個N端過氧化物酶樣胞外域,故稱為雙功能氧化酶。近年來,呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及腸胃道上皮等部位陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Duox基因表達(dá)。泌尿道上皮是否表達(dá)Duox目前未見文獻(xiàn)報道,本實(shí)驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法,觀察膀胱上皮細(xì)胞中是否存在Duox表達(dá),并初步探討基因的表達(dá)調(diào)控因素。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱上皮細(xì)胞株(T24)為本實(shí)驗(yàn)室保存,RPMI-1640為GIBCO產(chǎn)品,新生小牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司,佛波酯(PMA)購自 sigma公司,細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ)為 PeproTech公司產(chǎn)品,Trizol試劑購自 Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)試劑盒購自M BI公司,Taq mix DNA聚合酶,DL2000 DNA Marker為天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激 T24細(xì)胞采用含有10%新生小牛血清的1640培養(yǎng)基(無抗生素)常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)前在每個細(xì)胞培養(yǎng)皿(60×15mm)中接種30萬個T24細(xì)胞,37℃5%CO2孵箱培養(yǎng) 24h。加入 PMA(濃度為5nM)或細(xì)胞因子(TNF-α 20 ng?ml-1+IFN-γ20 ng?ml-1),分別在刺激后的12、24h收集細(xì)胞抽提RNA。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)無刺激的空白對照組。

1.2.2 PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank的序列,用Prime5.0軟件分別設(shè)計 Duox-1(登錄號 AF213465),Duox-2(登錄號AF267981),β-actin(登錄號 BC016045)的引物。

表1 PCR引物序列

1.2.3 總RNA提取 按 Trizol試劑說明操作。貼壁 T24細(xì)胞直接用Trizol試劑裂解,提取的總RNA用異丙醇沉淀,溶于經(jīng)過DEPC處理的水中,紫外分光光度計檢測其含量及純度。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在0.5ml的Eppendorf管中加入 RNasin 0.5μ l,Oligo(dt)1μ l,總 RNA 1μ l,M gCl24μ l,10(buffer 緩沖液2μ l,逆轉(zhuǎn)錄酶1μ l,用DEPC處理過的水補(bǔ)足至總體積20μ l,混勻,42℃反應(yīng) 40min,95℃5min終止反應(yīng),冰浴冷卻5min,-70℃保存。

1.2.5 PCR 擴(kuò) 增 Taq-mix 酶 12.5μ l,cDNA2μ l,上 游引 物0.5μ l,下游引物 0.5μ l,加水補(bǔ)足總體積 25μ l。Duox 反應(yīng)程序：94℃ 10min,94℃ 45s,53℃ 45s,72℃ 1min,40個循環(huán),最后72℃延伸10min,4℃保存。β-actin反應(yīng)程序：94℃3min,94℃30s,62℃30s,72℃1min,27個循環(huán),72℃5min,4℃保存。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的鑒定 取 5μ lPCR產(chǎn)物,加 1μ l 6×lodding buffer,以1×TAE電泳緩沖液,在2%瓊脂糖凝膠上電泳約60min,Bio-Rad凝膠圖像分析儀拍照,Quantity One分析軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性條帶進(jìn)行灰度掃描,以β-actin產(chǎn)物作校正分析,計算目的基因與內(nèi)參照β-actin灰度比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS軟件13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的鑒定

實(shí)驗(yàn)提取的細(xì)胞總RNA用紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值在1.79-1.90之間,表明所提RNA的純度較高,蛋白質(zhì)和DNA污染少。從凝膠電泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA兩條帶(圖1),其亮度之比約為2∶1,5sRNA帶不明顯,表明RNA沒有降解。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示Duox-1,Duox-2在T24細(xì)胞中有組成性表達(dá)(Constructive expression)。佛波酯(PMA)刺激后,Duox-1基因表達(dá)無明顯改變,而Duox-2基因表達(dá)增加,并以細(xì)胞刺激后12h表達(dá)量最高,與未刺激對照細(xì)胞相比增加4.5倍(P＜0.05)(圖2)。

聯(lián)合使用細(xì)胞因子 TNF-α和INF-γ,Duox-1基因表達(dá)無明顯變化,Duox-2基因表達(dá)顯著增高,以實(shí)驗(yàn)24h表達(dá)增加最為明顯,與未刺激對照細(xì)胞相比增加26.8(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

圖3細(xì)胞因子(TNF-α、INF-γ)對T24細(xì)胞Duox1、Duox2基因表達(dá)的影響

吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞)殺菌機(jī)理研究揭示,通過細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量超氧陰離子和活性氧(ROS),是吞噬細(xì)胞重要的殺菌方式。NADPH氧化酶(NADPH oxidase)是吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的關(guān)鍵酶,該酶在吞噬細(xì)胞特異表達(dá)?；蛲蛔兌筃ADPH氧化酶活性喪失的病人很容易感染細(xì)菌和真菌,這種疾病稱為慢性肉芽腫病(Chronic granulomatous disease,CGD)。2000年以來,通過基因同源檢索,發(fā)現(xiàn)人的基因組中另外還有6個基因編碼的蛋白分子與NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)和活性相似,因此具有NADPH氧化酶活性的分子被重新分類,分別稱為NOX1-5(NOX是NADPH oxidase的簡稱)以及Duox-1和Duox-2。在吞噬細(xì)胞特異表達(dá)的NADPH氧化酶現(xiàn)在稱為NOX2,而其他NOX分子廣泛表達(dá)于機(jī)體的上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞[4-6]。

活性氧(ROS)參與了許多重要生命活動,比如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫防御、組織損傷等,因此細(xì)胞(特別是非吞噬細(xì)胞)產(chǎn)生活性氧的分子基礎(chǔ)受人關(guān)注。雙功能氧化酶(Duox-1、Duox-2)是 NADPH氧化酶(NOX)家族的兩個重要成員,最早發(fā)現(xiàn)它們在甲狀腺中高表達(dá),研究表明Duox2基因突變將使甲狀腺激素合成減少,而Duox-1在甲狀腺中表達(dá)的生物學(xué)意義尚有待明確。近年來研究顯示Duox-1、Duox-2在呼吸道、腸道上皮細(xì)胞也有很高的表達(dá),并把它們與這些粘膜部位的免疫防御功能相聯(lián)系,氣管上皮細(xì)胞Duox-2產(chǎn)生的過氧化氫在乳過氧化物酶及硫氰酸鹽存在的情況下生成具有抗菌活性的次硫氰酸鹽,可能是呼吸道上皮的一種抗菌機(jī)制[7-8]。

雙功能氧化酶(Duox-1、Duox-2)是否在泌尿道粘膜上皮表達(dá)目前未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過 RT-PCR檢測表明在膀胱上皮細(xì)胞 T24中 Duox-1、Duox-2有組成性表達(dá),并且佛波酯(PM A)以及炎癥細(xì)胞因子(TNF-α和IFN-γ)作用均能刺激細(xì)胞Duox-2的表達(dá),但兩種刺激因素并不能改變Duox-1的表達(dá),這與呼吸道上皮細(xì)胞雙功能氧化酶表達(dá)調(diào)控研究比較相似,Duox-2表達(dá)受 IFN-γ刺激,而Duox-1表達(dá)受 IL-4和 IL-13刺激[9]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膀胱上皮細(xì)胞表達(dá)雙功能氧化酶,因此它們在泌尿道粘膜的生物學(xué)功能值得研究。而炎癥刺激增加Duox-2基因表達(dá),提示雙功能氧化酶可能參與膀胱粘膜免疫防御過程,為膀胱粘膜抗感染機(jī)制研究提供了新的線索。

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