棉蚜吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒不同品系解毒酶活性測(cè)定和增效劑作用的研究

郭天鳳，史雪巖，高希武，劉曉寧

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)系，北京100193，2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第七師農(nóng)科所，新疆奎屯 833200;3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

棉蚜Aphis gossypii 寄主范圍廣泛，世代周期短，繁殖率高，世代重疊，有無(wú)性生殖和有性生殖兩種生殖方式，在棉花生長(zhǎng)季節(jié)主要營(yíng)孤雌生殖，屬于r-對(duì)策害蟲(chóng)。目前對(duì)棉蚜具有較好防治效果的殺蟲(chóng)藥劑主要是新煙堿類殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒等。近幾年來(lái)，隨著吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的廣泛使用，棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的抗藥性問(wèn)題，引起了普遍的關(guān)注。

在靶標(biāo)抗性、穿透抗性以及代謝抗性等多種昆蟲(chóng)的抗藥性機(jī)制中，昆蟲(chóng)解毒酶代謝能力增強(qiáng)所導(dǎo)致的代謝抗性是昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)藥劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制之一(邢劍飛等，2010)。昆蟲(chóng)體內(nèi)的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)以及多功能氧化酶(MFO)等作為重要的解毒酶，其活性的增加及變化是導(dǎo)致昆蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生的主要原因。

增效劑是生物解毒代謝酶的有效抑制劑，如增效醚(PBO)是昆蟲(chóng)體內(nèi)多功能氧化酶(MFO)的抑制劑，順丁烯二酸二乙酯(DEM)是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的特異性抑制劑，磷酸三苯酯(TPP)是酯酶(Est)的專一性抑制劑。在殺蟲(chóng)藥劑中添加適量的增效劑后，可對(duì)害蟲(chóng)中解毒代謝酶產(chǎn)生抑制作用，從而顯著提高殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)效果。增效劑的使用，對(duì)于減少殺蟲(chóng)藥劑的用量，降低生產(chǎn)和使用殺蟲(chóng)劑成本，以及降低殺蟲(chóng)藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)害蟲(chóng)的抗藥性進(jìn)行有效的治理，均十分重要(陳召亮等，2007)。

昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)藥劑的代謝抗性與昆蟲(chóng)體內(nèi)多種解毒酶的活性變化具有密切的關(guān)系。為了有效延緩棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒抗性的產(chǎn)生，保證吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒在棉蚜防治中的長(zhǎng)期有效使用，掌握棉蚜解毒代謝酶活性變化與其對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒抗性形成之間的關(guān)系，具有重要的意義。因此，本工作在室內(nèi)篩選了棉蚜抗、感吡蟲(chóng)啉及啶蟲(chóng)脒品系的基礎(chǔ)上，比較了棉蚜吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GSTs)和細(xì)胞色素 P450sO-脫乙基(ECOD)酶的比活力差異，對(duì)棉蚜抗吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的生物化學(xué)機(jī)制進(jìn)行了初步研究。同時(shí)，為了掌握各種解毒酶變化在棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉抗性形成中的作用，本工作通過(guò)分別使用酯酶、P450 單加氧酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的抑制劑TPP、PBO 和DEM為增效劑，研究了增效劑在吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒對(duì)棉蚜抗、感品系毒力中的增效作用，為使用吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒，以及結(jié)合增效劑進(jìn)行抗性棉蚜治理，提供了必要的研究數(shù)據(jù)。本研究對(duì)于制定合理有效的棉蚜抗性治理措施，具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

SP-2000UV 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備總廠);5417C/R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，Germany);YKH-I 型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);HZQ-C 型空氣浴恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);LS55 Luminescence Spectrometer 熒光分光光度計(jì)(Perkin Elmer)

1.2 試蟲(chóng)來(lái)源、藥劑及來(lái)源

試蟲(chóng)來(lái)源:

實(shí)驗(yàn)室篩選的吡蟲(chóng)啉抗性和敏感品系(抗性倍數(shù)是83.27 倍);

實(shí)驗(yàn)室篩選的啶蟲(chóng)脒抗性和敏感品系(抗性倍數(shù)是82.33 倍)。

藥劑及來(lái)源:

96.0%吡蟲(chóng)啉原藥和98.5%啶蟲(chóng)脒原藥(山東聯(lián)合化工廠股份有限公司生產(chǎn));

α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate，α-NA)，毒扁豆堿(eserine)，由Fluka 公司提供;1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，二硫蘇糖醇(1，4-Dithiothreitol，DTT)，7-乙氧基香豆素 (7-ethoxycoumarin，7-EC)，苯甲基 磺酰氟(phenylmethylsulfonyl，PMSF)，考馬斯亮藍(lán)(coomassie brilliant blue G-250)，固藍(lán)B 鹽(fast blue B salt)，十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，牛血清蛋白(bovine serum albumi，BSA)，由美國(guó)Sigma 公司提供;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、甘油(glycerol)、KH2PO4及Na2HPO4均為分析純，由北京化學(xué)試劑公司提供;98%增效醚(piperonyl buoxide，PBO)，由美國(guó)Chem Service 公司提供;順丁烯二酸二乙酯 (Diethyl maleate，DEM)，由美國(guó)Chem Service 公司提供;磷酸三苯酯(Triphenylphosphate，TPP)，由美國(guó)New Jersey 公司提供。

1.3 吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒對(duì)棉蚜毒力生物測(cè)定

吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒對(duì)棉蚜的毒力測(cè)定，仿Moores 等(1996)的方法進(jìn)行，并加以改進(jìn)。

1.4 增效劑試驗(yàn)

首先測(cè)定獲得PBO、DEF、DEM 對(duì)抗性和敏感品系棉蚜無(wú)致死作用的最高濃度 (分別為100 mg/L，50 mg/L 和50 mg/L)，以確保對(duì)照組的對(duì)照效果。然后采摘種植的非轉(zhuǎn)基因無(wú)蟲(chóng)棉花葉片，用打孔器將棉花葉片打孔。將其浸入無(wú)致死的最高濃度增效劑中浸30 s 后取出，置陰涼通風(fēng)處晾干，放入底層鋪有1 mL 1%瓊脂凝膠的燒杯中。用毛筆小心將無(wú)翅成蚜接入葉片上，飼養(yǎng)12 h 后，將此經(jīng)增效劑處理的棉蚜按1.3的方法，進(jìn)行吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒對(duì)棉蚜毒力的生物測(cè)定。增效值用Bradford (1976)的方法計(jì)算增效比，(SR)=單一藥劑對(duì)棉蚜的LC50值/藥劑對(duì)增效劑處理的棉蚜的LC50值。

1.5 棉蚜中3 種解毒酶比活力的測(cè)定

1.5.1 棉蚜羧酸酯酶活性測(cè)定

(1)酶液制備:挑取抗性、敏感無(wú)翅成蚜300頭，加入1 mL 0.4 M 磷酸緩沖液，充分勻漿，10080 rpm 離心15 min，取上清液作為母液，重復(fù)3 次，-80℃冷凍保存。

(2)活性測(cè)定:參照Van Aspern (1962)的方法并加以修改。取3 只試管，在每個(gè)試管中依次加入0.45 mL 磷酸緩沖液(0.04 M，pH7.0)、1.8 mL 3×10-4M α-NA (α-NA:毒扁豆堿1∶1)、0.05 mL 酶液。30℃反應(yīng)15 min 后，加入顯色劑(1%固藍(lán)B 鹽:5%SDS，2∶5 顯色劑)終止反應(yīng)并顯色，靜置5-10 min 后在600 nm 下測(cè)定吸光值。對(duì)照管中不加酶液，于加入顯色劑之后補(bǔ)加0.05 mL 酶液。每個(gè)處理重復(fù)三次，每個(gè)重復(fù)三次測(cè)定。根據(jù)得出的吸光值(OD)平均值和測(cè)得的酶液的蛋白含量，求出羧酸酯酶的比活力。

1.5.2 棉蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力測(cè)定

(1)酶液制備:稱取約50-60 mg 棉蚜成蟲(chóng)，于冰浴中加入2 mL pH6.5的磷酸緩沖液進(jìn)行勻漿，10000 g 4℃下離心30 min，取上清作為粗酶液，重復(fù)3 次，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

(2)活性測(cè)定:參照Habig 等(1981)方法進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為900μL，依次加入pH 6.5的磷酸緩沖液0.64 mL、0.03 mL 30 mM 還原型谷胱甘肽(GSH)作底物、粗酶液0.2 mL 及0.03 mL 30 mM 1-氯-2，4-二硝基 苯(CDNB)，于340 nm 波長(zhǎng)下記錄2 min 內(nèi)的吸光值變化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)三次獨(dú)立重復(fù)，每次重復(fù)平行測(cè)定三次。根據(jù)得出的吸光值(OD)平均變化值和測(cè)得的酶液的蛋白含量，求出谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力。

1.5.3 細(xì)胞色素P450-O-脫乙基比活力測(cè)定

(1)酶液制備:稱取約200 mg 棉蚜成蟲(chóng)，冰浴勻漿，勻漿液為pH7.5 磷酸緩沖液(含0.4 M DTT、0.4 M PMSF、20%甘油)。10000 g 4℃下離心約20 min，取上清作為粗酶液，并用7-8 層濾紙過(guò)濾后立即用于反應(yīng)測(cè)定。

(2)活性測(cè)定:主要參照Aitio (1978)的方法測(cè)定棉蚜7-乙氧基香豆素O-脫乙基(ECOD)比活力。在650μL 0.1 M pH7.0 Tris-HCl 緩沖液中，加入底物6μL 10 mM 7-乙氧基香豆素，加入6μL 12 mM NADPH 以啟動(dòng)反應(yīng)，加入粗酶液250μL。于35℃下反應(yīng)15 min，加入15% TCA 300μL終止反應(yīng)后，加入450μL Gly-NaOH。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物7-羥基香豆素的熒光值。檢測(cè)條件:發(fā)射光波長(zhǎng)456 nm，激發(fā)光波長(zhǎng)368 nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)三次獨(dú)立重復(fù)，每次重復(fù)平行測(cè)定三次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)用POLO 軟件(LeOra Software Inc.，California，USA)或SAS 軟件計(jì)算毒力回歸方程的斜率值(Slope ±SE)，LC50及其95%置信限及卡方值等。采用EXCEL 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TPP、PBO 和DEM 在吡蟲(chóng)啉敏感和抗性棉蚜品系中對(duì)吡蟲(chóng)啉毒力的增效比

從表1 可知，吡蟲(chóng)啉對(duì)棉蚜吡蟲(chóng)啉敏感和抗性品系的LC50分別為0.176 和14.657 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在吡蟲(chóng)啉敏感品系中對(duì)吡蟲(chóng)啉毒力的增效比分別為1.12、1.09、0.97，而在吡蟲(chóng)啉抗性品系中的增效比分別為2.02、1.75、1.05，可見(jiàn)，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜吡蟲(chóng)啉敏感和抗性品系中對(duì)吡蟲(chóng)啉的毒力均有明顯的增效作用，且在抗性品系中的增效作用顯著高于敏感品系，其中TPP 對(duì)抗性棉蚜的增效比大于2。

表1 增效劑PBO、DEM、TPP 在吡蟲(chóng)啉敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中對(duì)吡蟲(chóng)啉毒力的增效作用Table 1 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on imidacloprid in the SS and RR stains ofcotton aphid (Aphids gossypii)

2.2 TPP、PBO 和DEM 在啶蟲(chóng)脒敏感和抗性棉蚜品系中對(duì)啶蟲(chóng)脒毒力的增效比

從表2 可以看出，啶蟲(chóng)脒棉蚜啶蟲(chóng)脒敏感和抗性品系的LC50分別為0.18 和14.819 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在啶蟲(chóng)脒敏感棉蚜品系中對(duì)啶蟲(chóng)脒毒力的增效比僅為1.02、1.03、1.02，在啶蟲(chóng)脒抗性棉蚜品系中對(duì)啶蟲(chóng)脒毒力的增效比為1.77、1.61、1.04，可見(jiàn)，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜啶蟲(chóng)脒敏感和抗性品系中對(duì)啶蟲(chóng)脒的毒力均有明顯的增效作用，且在抗性品系中的增效作用顯著高于敏感品系，其中TPP 對(duì)抗性棉蚜的增效比大于1.77。

2.3 吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性品系和敏感品系棉蚜中解毒酶比活力比較

從表3 可以看出，吡蟲(chóng)啉抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差異非常顯著，棉蚜抗吡蟲(chóng)啉品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 倍。說(shuō)明棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強(qiáng)有關(guān)?？惯料x(chóng)啉棉蚜品系的細(xì)胞色素P450-O-脫乙基酶活性是敏感品系的1.60 倍，表明棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性形成與棉蚜細(xì)胞色素P450s O-脫乙基活性的增加具有一定的關(guān)系?？惯料x(chóng)啉棉蚜品系的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性是敏感品系的1.08 倍，表明棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性形成與棉蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系不大。

表2 增效劑PBO、DEM、TPP 在敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中對(duì)啶蟲(chóng)脒毒力的增效作用Table 2 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on acetamiprid in the SS and RR stains of cotton aphid (Aphids gossypii)

表3 吡蟲(chóng)啉抗性和敏感棉蚜品系3 種解毒酶比活力的比較Table 3 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to imidacloprid

表4的結(jié)果可以看出，啶蟲(chóng)脒抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差異非常顯著，棉蚜抗啶蟲(chóng)脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的2.91 倍，棉蚜對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強(qiáng)有關(guān)。抗啶蟲(chóng)脒棉蚜品系的細(xì)胞色素P450-O-脫乙基酶活性是敏感品系的1.69 倍，表明棉蚜對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗性形成與棉蚜細(xì)胞色素P450s O-脫乙基活性的增加具有一定的關(guān)系?？灌はx(chóng)脒棉蚜品系的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性是敏感品系的1.04 倍，表明棉蚜對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗性形成與棉蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系不大。

表4 啶蟲(chóng)脒抗性和敏感棉蚜品系3 種解毒酶比活力的比較Table 4 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to acetamiprid

3 討論與結(jié)論

本研究利用室內(nèi)篩選獲得的吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性和敏感品系，研究了增效劑的增效作用，發(fā)現(xiàn)TPP 和PBO 在吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒敏感品系棉蚜中增效作用不明顯，但在抗性品系中的增效作用顯著。TPP 和PBO 在吡蟲(chóng)啉抗性品系棉蚜中的增效比為2.02 和1.75，在啶蟲(chóng)脒抗性品系棉蚜中的增效比為1.77 和1.61。可見(jiàn)，羧酸酯酶及細(xì)胞色素P450 酶活性的變化是棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉及啶蟲(chóng)脒產(chǎn)生抗性的主要原因之一。

在殺蟲(chóng)劑的選擇壓力下，昆蟲(chóng)羧酸酯酶產(chǎn)生了相應(yīng)的進(jìn)化的反應(yīng)，導(dǎo)致抗性昆蟲(chóng)中羧酸酯酶活性有所增高，是一種重要的抗性機(jī)制。如昆蟲(chóng)中羧酸酯酶活性增高，引起了害蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生。這些在庫(kù)蚊Culex (Hemingwayetal et al.，2004)，褐飛虱Nilaparvata lugens (Small and Hemingway，2000)，桃蚜Myzus persicae (Field et al.，1999)，棉蚜Aphis gossypii Glover (Cao et al.，2008;Pan et al.，2009)，東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis (Zhang et al.，2011)中都有發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，棉蚜吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶活性差異非常顯著。棉蚜抗性吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 和2.91 倍。因此，棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒的抗性形成與其羧酸酯酶活性的增強(qiáng)，也有著非常密切的關(guān)系。

P450 單加氧酶活力升高是多種害蟲(chóng)對(duì)吡蟲(chóng)啉產(chǎn)生抗性的普遍機(jī)制，在多種抗吡蟲(chóng)啉害蟲(chóng)中均有發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞色素P450 單加氧酶是參與外源性化學(xué)物質(zhì)包括殺蟲(chóng)劑解毒的重要代謝酶系。細(xì)胞色素P450 單加氧酶活性的提高，增強(qiáng)了昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯和新煙堿類殺蟲(chóng)劑的抗藥性，這種抗性機(jī)制在淡色庫(kù)蚊Culex pipiens pallens、德國(guó)小蠊Blattella germanica、小菜蛾P(guān)lutella xyllostella、煙粉虱Bemisia tabaci、赤擬谷盜Tribolium castaneum Herbst、桃蚜Myzus persicae的研究中均有報(bào)道(Shen et al.，2003;Pridgeon et al.，2003;Bautista et al.，2009;Karunkeretal et al.，2008;Zhu et al.，2010;Puinean et al.，2010)。

細(xì)胞色素P450 單加氧酶通過(guò)降低殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)效果，而表現(xiàn)為害蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生。如Sato 等 (2001，2007)報(bào)道了細(xì)胞色素P450 單加氧酶的氧化代謝機(jī)制，是捕食性鈍綏螨對(duì)殺撲磷抗性的產(chǎn)生的機(jī)制。家蠅CYP6A1 基因轉(zhuǎn)錄的增加，導(dǎo)致了其對(duì)殺蟲(chóng)劑二嗪農(nóng)抗性的產(chǎn)生(李芬等，2012)。本研究表明，棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性品系的細(xì)胞色素P450-O-脫乙基酶的活性顯著高于敏感品系，分別是敏感品系的1.60 倍和1.69 倍，說(shuō)明細(xì)胞色素P450-O-脫乙基酶的活性升高，也會(huì)降低吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒殺蟲(chóng)效果，從而引發(fā)棉蚜抗性的產(chǎn)生。

吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性棉蚜品系中羧酸酯酶活性、細(xì)胞色素P450-O-脫乙基酶活性，均明顯高于敏感品系。增效劑的增效作用實(shí)驗(yàn)和解毒酶活力比較表明，羧酸酯酶和多功能氧化酶在棉蚜對(duì)吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性產(chǎn)生中，發(fā)揮了重要作用，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶僅起到了一定輔助作用。在棉花生產(chǎn)中，應(yīng)繼續(xù)利用農(nóng)業(yè)、生物、物理防治等相結(jié)合的綜防技術(shù)，交替使用作用機(jī)制不同的殺蟲(chóng)劑，利用增效劑對(duì)酯酶和P450 單加氧酶活性產(chǎn)生的抑制作用，加入增效劑來(lái)提高防治效果，減少農(nóng)藥的使用量和使用次數(shù)并延緩其抗藥性發(fā)展。

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