刺桐姬小蜂成癭過(guò)程中蟲(chóng)癭內(nèi)幾種酶的活性變化

汪少妃，袁 毅，劉建強(qiáng)，朱 麟

(海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南省動(dòng)植物生態(tài)學(xué)省部共建實(shí)驗(yàn)室，?？?571158)

刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim 隸屬膜翅目Hymenoptera，姬小蜂科Eulophidae，嚙小蜂亞科Tetrastichinae，胯姬小蜂屬Q(mào)uadrastichus，是2004年新發(fā)現(xiàn)的一種檢疫性入侵害蟲(chóng)(焦 懿等，2006)。主要分布在毛里求斯、留尼汪、新加坡(Kim et al.，2004)、中國(guó)臺(tái)灣(Yang，2004)和中國(guó)廣東省的深圳與廣州、福建省的廈門(mén)、海南省的三亞與萬(wàn)寧等地(黃蓬英等，2005)。刺桐姬小蜂是一種重要的致癭害蟲(chóng)，專(zhuān)一為害刺桐屬Erythrina spp.的植物。成蟲(chóng)喜歡在刺桐的嫩枝、幼嫰的葉柄和葉片上產(chǎn)卵并誘導(dǎo)植物形成蟲(chóng)癭，卵、幼蟲(chóng)及蛹的發(fā)育均在蟲(chóng)癭內(nèi)完成(陳志麟等，2006)。蟲(chóng)癭是由造癭昆蟲(chóng)產(chǎn)卵或幼蟲(chóng)取食時(shí)一些分泌物的刺激后，而造成植物細(xì)胞加速分裂和異常分化形成的畸形瘤狀物或突起 (Stone and Schonrogge，2003)。蟲(chóng)癭的發(fā)育可分為初始形成期、成長(zhǎng)分化期、成熟期和開(kāi)裂期4個(gè)階段(Lalonde and Shorthouse，1984)。蟲(chóng)癭形成過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)(楊曼妙，2007)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和次生物質(zhì)含量改變，及保護(hù)酶活性變化(朱麟和古德祥，1999)。由于刺桐姬小蜂是近年入侵我國(guó)的檢疫性害蟲(chóng)，國(guó)內(nèi)研究主要集中在生物學(xué)特性和危害防治方面(Kim et al.，2004;Yang，2004;黃蓬英等，2005;楊偉東等，2005;陳志麟等，2006;焦懿等，2006;楊義標(biāo)等，2006;耿曉紅，2008)，關(guān)于刺桐姬小蜂危害后，寄主葉片生理變化未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)刺桐姬小蜂為害形成蟲(chóng)癭四個(gè)不同階段的保護(hù)酶活性進(jìn)行了測(cè)定，分析了蟲(chóng)癭不同階段保護(hù)酶活性變化規(guī)律，探討寄主植物對(duì)刺桐姬小蜂蟲(chóng)癭形成產(chǎn)生的抗性反應(yīng)，研究結(jié)果對(duì)于探討蟲(chóng)癭形成機(jī)制具有較重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

供試的寄主為盆栽的刺桐扦插苗，株高約50 cm，共計(jì)70 株。供試蟲(chóng)源為刺桐姬小蜂，于海南省?？谑胁杉掏┘》湮：Φ拇掏┲l，帶回實(shí)驗(yàn)室待其羽化后接種。

1.2 方法

1.2.1 接種方法

1.2.2 酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶 (SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定使用相關(guān)試劑盒，過(guò)氧化物酶(POD)的活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定(孔祥生和易現(xiàn)峰，2008)，多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定采用比色法(紀(jì)淑娟等，2010)。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行相同的前期處理，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g 待測(cè)葉片，按重量體積比9 倍生理鹽水冰浴下勻漿，制成10%的勻漿液，3000 r/min，離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定，酶液提取平行3 次，重復(fù)2 次。

SOD 活性測(cè)定:取對(duì)照管和測(cè)定管中分別加入雙蒸水、酶液和相關(guān)試劑，用漩渦混勻器混勻，置37℃水浴40 min 再加入顯色劑，雙蒸水調(diào)零，于波長(zhǎng)550 nm 處比色，測(cè)OD 值，計(jì)算SOD 活性以U/mg prot為單位。

CAT 活性測(cè)定:按照CAT 試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定先后在對(duì)照管和測(cè)定管中添加試劑和酶液，于405 nm處比色，測(cè)定各管OD 值，計(jì)算CAT 活性。

POD 活性測(cè)定:以愈創(chuàng)木酚為H2O2酶的底物，加入酶液，在470 nm 處測(cè)OD 值，以每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)POD 活性單位。

PPO 活性測(cè)定:取0.1 mol/L 鄰苯二酚1 mL加入4 mL pH6.1的磷酸緩沖液中，加入0.1 mL的酶液，于420 nm 處測(cè)定吸光度變化，每隔20 s 測(cè)一次，共測(cè)2 min。以每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)PPO 活性單位。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS16.0 for Windows 軟件計(jì)算原始數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行組間均值數(shù)據(jù)的One-Way ANOVA 方差分析，采用LSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD 活性影響

由圖1 可知，對(duì)照組中SOD 活性隨發(fā)育表現(xiàn)逐漸減低，非蟲(chóng)癭組織和蟲(chóng)癭組織中SOD 活性呈上升、下降再上升的趨勢(shì)，從成長(zhǎng)分化期開(kāi)始隨受害程度加重蟲(chóng)癭組織SOD 活性明顯高于對(duì)照組和非蟲(chóng)癭組織，達(dá)到差異極顯著水平(P＜0.01)，特別是在開(kāi)裂期是對(duì)照組的5.36 倍;在成熟期蟲(chóng)癭組織和非蟲(chóng)癭組織SOD 活性均明顯下降(P＜0.01);而非蟲(chóng)癭組織相比對(duì)照無(wú)明顯變化，說(shuō)明刺桐姬小蜂為害主要誘導(dǎo)蟲(chóng)癭部位SOD 酶活性變化，對(duì)非蟲(chóng)癭部位影響相對(duì)較小。

2.2 CAT 活性影響

CAT 酶活性變化趨勢(shì)(圖2)與SOD 相似，蟲(chóng)癭組織中酶活性均高于對(duì)照組，且達(dá)到差異極顯著(P＜0.01)，在成熟期增加達(dá)到14.23倍;非蟲(chóng)癭組織中CAT 活性先上升后下降，成長(zhǎng)分化期為對(duì)照組的8.77 倍，達(dá)到差異極顯著(P＜0.01)，到成熟期CAT 活性有所下降，但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。與SOD 酶活變化相似，CAT 活性的增加也主要體現(xiàn)在蟲(chóng)癭組織中。

圖1 刺桐姬小蜂誘導(dǎo)的蟲(chóng)癭不同發(fā)育階段SOD 活性Fig.1 The SOD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

圖2 刺桐姬小蜂誘導(dǎo)的蟲(chóng)癭不同發(fā)育階段CAT 活性Fig.2 The CAT activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

2.3 POD 活性影響

從圖3 可以看出，相比對(duì)照組POD 酶活性增加主要體現(xiàn)在非蟲(chóng)癭組織上，且每個(gè)時(shí)期和對(duì)照相比顯著增加(P＜0.01);到開(kāi)裂期為對(duì)照的2.16 倍;雖然蟲(chóng)癭組織中POD 酶活性呈上升趨勢(shì)，但在前三個(gè)時(shí)期均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);而在開(kāi)裂期蟲(chóng)癭中的酶活為對(duì)照組2.66 倍，與非蟲(chóng)癭組織比也達(dá)到差異極顯著水平(P＜0.01)。

2.4 PPO 活性影響

多酚氧化酶(PPO)可氧化酚類(lèi)化合物，同時(shí)也是木質(zhì)素的合成前體(毛愛(ài)軍，2003)，為植物抗性的重要酶指標(biāo)。由圖4 可知，除初始形成期外，蟲(chóng)癭組織和非蟲(chóng)癭組織中的PPO 活性均比對(duì)照組要高，蟲(chóng)癭組織中的酶活隨發(fā)育逐漸上升，到開(kāi)裂期為對(duì)照的19.73 倍;各時(shí)期相比對(duì)照組和非蟲(chóng)癭組織的PPO 酶活性均達(dá)到差異極顯著水平(P＜0.01);而成熟期非蟲(chóng)癭組織比對(duì)照升高不顯著(P ＞0.05)。所以，在蟲(chóng)癭的不同發(fā)育階段PPO 酶活性主要體現(xiàn)在蟲(chóng)癭組織中。

圖3 刺桐姬小蜂誘導(dǎo)的蟲(chóng)癭不同發(fā)育階段POD 活性Fig.3 The POD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

圖4 刺桐姬小蜂誘導(dǎo)的蟲(chóng)癭不同發(fā)育階段PPO 活性Fig.4 The PPO activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

3 結(jié)論與討論

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量與保護(hù)酶系統(tǒng)之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)(Prasad，1996)，一旦植物受到逆境脅迫，正常的氧代謝受阻，使得植物體內(nèi)的活性氧含量會(huì)迅速積累，加速了膜脂過(guò)氧化作用從而導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，引起細(xì)胞膜的通透性增加及電解質(zhì)的滲漏，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織被損壞，使得植物處于一種損傷狀態(tài)(Havlickova et al.，1996;程璐，2009)，而SOD、CAT、POD 和PPO 是細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶。本試驗(yàn)研究表明，受刺桐姬小蜂危害后受害葉片內(nèi)保護(hù)酶(SOD、CAT、POD、PPO)活性顯著提高，說(shuō)明刺桐姬小蜂蟲(chóng)癭的形成誘導(dǎo)刺桐的保護(hù)酶產(chǎn)生，表現(xiàn)出了明顯的防御反應(yīng)。

SOD的主要作用是清除O-2，同時(shí)產(chǎn)生歧化性產(chǎn)物H2O2;而CAT 在保護(hù)酶系中主要起到降解H2O2的作用(Prasad，1996)，能有效地阻止O-2和H2O2在植物體內(nèi)的積累，防止自由基對(duì)細(xì)胞的毒害(張庭偉和劉長(zhǎng)仲，2011)。本次試驗(yàn)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):SOD 和CAT 活性變化主要表現(xiàn)在蟲(chóng)癭組織中;刺桐姬小蜂的刺激，導(dǎo)致植物體內(nèi)O-2大量產(chǎn)生，使得蟲(chóng)癭中SOD 活性迅速上升，到成熟期，由于刺桐姬小蜂化蛹取食活動(dòng)的停止酶活性有所下降;CAT 主要還原SOD 作用的產(chǎn)物，所以其活性變化的趨勢(shì)和機(jī)理與SOD 相似。說(shuō)明刺桐姬小蜂的取食活動(dòng)與寄主植物生理生化變化相關(guān)。

POD 和PPO 可通過(guò)參與木質(zhì)素的合成和細(xì)胞壁蛋白的交聯(lián)化作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞壁進(jìn)一步加厚，可以有效的防治其他生物的捕食和入侵(Gaspar et al.，1982;Macadam et al.，1992;Lamb and Dixon，1997;Allison and Schultz，2005;衛(wèi)麥霞等，2008)。測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPO 活性在整個(gè)蟲(chóng)癭發(fā)育階段呈上升趨勢(shì)，初期增加較緩，隨后逐步高于對(duì)照;PPO 作用提高了蟲(chóng)癭組織的木質(zhì)化程度，對(duì)生活在蟲(chóng)癭內(nèi)的蟲(chóng)體起到一定的保護(hù)作用，與(王召元，2007;王洪濤，2011;呂文玲，2012)研究結(jié)果相似。而POD 活性在蟲(chóng)癭組織中明顯比對(duì)照要低，這是刺桐抗蟲(chóng)性較低的生理生化機(jī)制之一，也是造癭昆蟲(chóng)與寄主植物協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，這與李諾等(2010)對(duì)桉樹(shù)枝癭姬小蜂蟲(chóng)癭研究結(jié)果一致。非蟲(chóng)癭部分PPO 和POD 活性都顯著高于對(duì)照，可能是寄主通過(guò)增加蟲(chóng)癭周?chē)M織細(xì)胞壁的厚度，來(lái)防止刺桐姬小蜂在葉片上的再次產(chǎn)卵，也是植物的一種自我保護(hù)作用。

本研究?jī)H對(duì)刺桐姬小蜂危害后，刺桐葉片中不同時(shí)期這四種保護(hù)酶的變化。這些酶活性與刺桐姬小蜂的取食活動(dòng)有關(guān)，同時(shí)也表現(xiàn)出了寄主植物的抗性作用。但對(duì)于植物整體防御機(jī)制可能還涉及到其他生理生化反應(yīng)及分子水平上的調(diào)控機(jī)制等方面，仍需有待進(jìn)一步研究。

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