苦瓜葉萃取物對亞洲玉米螟代謝酶活性的影響

朱春亞，劉 歡，曹 溪，張茂新，凌 冰

(華南農業(yè)大學昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642)

苦瓜Momordica charantia L.屬于葫蘆科植物，廣泛分布于熱帶非洲和亞洲(Grover et al.，2004;Subratty et al.，2005)，是一種常見蔬菜，因其全株包括果實味極苦而得名。與其他葫蘆科植物相比，苦瓜的生長更少受到蟲害的為害。大量研究證實，苦瓜葉片中含有豐富的具抗蟲活性的次生物質，它們對多種農業(yè)害蟲有明顯的拒食、抑制生長發(fā)育作用和毒殺作用(Chandravadana and Pai，1987;Yasui et al.，1998;Abe and Matsuda，2000;李紹勤等，2001;凌冰等，2009;駱穎等，2012)。

但有關苦瓜次生物質對昆蟲作用機制的研究卻很少。駱穎等測定了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對斜紋夜蛾幼蟲中腸蛋白酶和淀粉酶活性的影響(駱穎等，2012)，而對昆蟲其它酶系的影響尚未見報道。藻糖酶可以將昆蟲體內的海藻糖水解成葡萄糖而被昆蟲利用，在昆蟲的能量代謝上扮演著重要角色(王軍娥和劉靜，2009)。羧酸酯酶、堿性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶是昆蟲抵抗外來有毒物質的重要解毒酶系，可參與植食性昆蟲對植物次生物質的抗性，對維持昆蟲的正常生理代謝起重要作用 (陳長琨，1993;陳鳳菊等，2003)。我們研究了苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(Güenée)幼蟲體內上述酶系活性的影響，旨在闡明苦瓜葉片抗蟲次生物質的作用機理，為能將其開發(fā)為一類新型的具有良好環(huán)境和諧性的植物性殺蟲劑提供科學依據。同時，對進一步揭示苦瓜抗蟲的化學機制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑與化學試劑

供試藥劑是從苦瓜葉乙醇粗提物中用乙酸乙酯萃取獲得的膏狀物(凌冰等，2008);化學試劑:α-萘酚、α-乙酸萘酯、固藍鹽B、SDS、硫代碘化乙酰膽堿、5，5-二硫基-雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、牛血清蛋白、還原型谷胱甘肽等均為Sigma 公司產品;毒扁豆堿和1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)為BBL 公司產品;對硝基苯基磷酸二鈉和對硝基酚為Amresco 公司產品;考馬斯亮藍G250為北京鼎國生物技術有限責任公司產品。

1.2 供試蟲源及飼養(yǎng)方法

亞洲玉米螟由中山大學提供，采用陳其津(2000)的飼料配方在室內繁殖3 代。嚴格挑選發(fā)育均一的3 齡幼蟲，饑餓4 h，然后分別用添加了不同劑量苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的人工飼料飼養(yǎng)72 h。苦瓜葉乙酸乙酯萃取物添加到人工飼料時，先配制成不同濃度的丙酮溶液，當人工飼料冷卻至40℃時，按飼料與藥液等于5∶1的比例加入人工飼料中充分混勻，對照飼料中亦加入等量的丙酮。

1.3 酶液的制備

幼蟲15 頭一組放入預冷的玻璃勻漿器中，加入5 mL pH7.0的0.1 mol/L 磷酸緩沖液在冰浴條件下勻漿。勻漿液在4000 r/min、4℃離心10 min，取上清液作酶源，-20℃保存待測。

1.4 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟不同酶活力的影響測定

1.4.1 海藻糖酶活性測定:參照鐘國華等(2000)的方法。用0.02 mol/L的PBS 緩沖液(pH5.8)5 mL 提取酶液。取0.25 mL 酶液加入0.5 mL 2 mmol/L海藻糖標準液中混勻，在37℃水浴中培養(yǎng)60 min。取1 mL 反應液，加入3，5-二硝基水楊酸試劑2 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻后用iMark 酶標儀13601 (伯樂)測定其550 nm處的光密度值(OD)。以考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，根據標準曲線方程計算葡萄糖含量，酶活力以μmol(葡萄糖)/mg (蛋白質)·min 表示。

1.4.2 磷酸酯酶活力測定參照Bessey (1946)的方法。酸性磷酸酯酶活力的測定，取酶液0.2 mL加入到2.3 mL的0.2 mol/L 醋酸緩沖液(pH4.6)中，再加入0.0075 mol/L 對硝基苯基磷酸二鈉0.5 mL，37℃水浴30 min 后加入2.0 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液混勻，測其400 nm 處的OD 值。堿性磷酸酯酶活力的測定是用0.05 mol/L碳酸緩沖液(pH10.0)代替0.2 mol/L 醋酸緩沖液，其他均與酸性磷酸酯酶測定方法相同。用對-硝基苯酚作標準曲線計算酶活力。

1.4.3 羧酸酯酶活力測定:參照Van Asperene(1962)的方法。取上述10μL 酶液加入3.49 mL 0.04 mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中混勻，再加入0.5 mL 4×10-4mol/L的α-乙酸萘酯液，37℃水浴30 min 后加入0.5 mL 顯色劑(0.1%固牢藍B鹽與SDS 溶液按2 ∶5 混合)終止反應，靜置10 min，用iMark 酶標儀13601 (伯樂)測定其600 nm 處的光密度值。重復3 次(下同)。以不同濃度的α-萘酚作標準曲線。

1.4.4 谷胱甘肽-S-轉移酶活力測定:參照Booth (1961)方法。反應混合液含0.1 mL 酶液，2.9 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液 (pH8.0)、0.7 mL 0.03 mol/L的谷胱甘肽液和 50μL 0.1 mol/L的CDNB 液，在25℃水浴中反應30 min后加熱使其失活，測定350 nm 處OD 值。

1.5 可溶性蛋白含量測定

采用Brandford (1976)法測定，以牛血清蛋白為標準蛋白，測定可溶性蛋白含量。實驗求得標準曲線方程為 Y=0.0693x+0.0044，R2=0.9968。

1.6 實驗數據分析

獲得的數據采用SAS 9.0 版軟件的方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計處理。并用鄧肯氏新復極差檢驗法(Duncan's multiple range test，DMRT)檢驗不同濃度處理間的差異顯著性(P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶的抑制作用

用含有0.025%-0.4% 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的飼料飼喂3 齡亞洲玉米螟幼蟲，24 h、48 h 和72 h 分別測定其海藻糖酶比活力。圖1 顯示了不同劑量的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶活性的影響。結果表明，0.025%-0.4%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶活力均有明顯的抑制作用。隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加，海藻糖酶的比活力逐漸降低，且明顯低于對照(24 h:F5，17=25.83，P＜0.0001;48 h:F5，17=101.98，P＜0.0001;72 h:F5，17=71.03，P＜0.0001);隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物處理時間的延長，對海藻糖酶活力的抑制作用也逐漸增強。處理24 h-72 h，0.2%萃取物處理的相對活力(以對照比活力為100%)平均比對照減少了32.3%，0.4%處理的相對活力平均比對照減少了40.8%。

圖1 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲海藻糖酶的相對活力Fig.1 Changes of trehalas relative activity dependent on dosage of theethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia Furnacalis

2.2 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲磷酸酯酶活性的抑制作用

不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性的影響見圖2。從圖2A 可以看出，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟幼蟲堿性磷酸酯酶的活性有明顯抑制作用。處理24 h、48 h 和72 h，除了低濃度(0.0125%)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對該酶活力的影響與對照差異不顯著外，0.05%以上濃度處理組堿性磷酸酯酶比活力均顯著低于對照 (24 h:F5，17=65.68，P＜0.0001;48 h:F5，17=107.58，P＜0.0001;72 h:F5，17=6.05，P=0.0051)。處理24-72 h，0.2%處理的相對活力平均比對照減少了34.1%。

從圖2B 可以看出，處理24 h，0.0125%-0.1%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對酸性磷酸酯酶活力均表現出誘導效應，相對活力比對照高出48%-67%(F5，17=36.29，P＜0.0001)，而高濃度(0.2%)處理的相對活力與對照差異不顯著。處理48 h 和72 h，除了低濃度(0.0125%)處理酸性磷酸酯酶活力與對照差異不顯著外，0.05%以上的濃度均有明顯的抑制作用，酸性磷酸酯酶比活力均顯著低于對照(48 h:F5，17=98.11，P＜0.0001;72 h:F5，17=31.87，P＜0.0001)?？喙先~乙酸乙酯萃取物處理初期對酸性磷酸酯酶活性的誘導作用可能是蟲體對外源物的一種應急反應，隨后的被抑制現象可能因為蟲體的生理機能下降引起的。

圖2 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟磷酸酯酶的相對活力Fig.1 Changes of phosphatase relative specific activity dependent on dosage of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.3 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟羧酸酯酶活性的影響

從圖3 可以看出，在處理后24 h，0.0125%-0.2%苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對羧酸酯酶活性均有明顯的抑制作用，其抑制作用隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加而增強(24 h:F5，17=36.29，P＜0.0001);但48 h，0.0125%-0.1%處理組羧酸酯酶的活性逐漸恢復，與同期對照差異不顯著，高濃度(0.2%)處理表現出一定的誘導作用(48 h:F5，17=4.11，P=0.0208)。72 h，各濃度處理羧酸酯酶活性均與同期對照差異不顯著(72 h:F5，17=1.52，P=0.2542)。

圖3 不同濃度苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟羧酸酯酶的比活力Fig.3 Changes ofcarboxyl esterases specificactivity dependent on dosage of of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves in larvae of Ostrinia furnacalis

2.4 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟谷胱甘肽-S-轉移酶活性的影響

從表1 可以看出，含有低濃度(0.0125%和0.025%)苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的飼料飼喂亞洲玉米螟3 齡幼蟲24 h 和48 h 后，對其谷胱甘肽-S-轉移酶活性沒有明顯的影響，但用0.05%以上的濃度飼喂對亞洲玉米螟幼蟲谷胱甘肽-S-轉移酶活性卻有明顯的誘導作用(24 h:F5，17=17.79，P＜0.0001;48 h:F5，17=20.34，P＜0.0001)。72 h，隨著亞洲玉米螟幼蟲的不斷取食，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物在其體內的積累逐漸增多，對谷胱甘肽-S-轉移酶誘導作用亦隨著增強，低濃度(0.0125%和0.025%)的處理也表現出明顯的誘導作用(72 h:F5，17=73.72，P＜0.0001)。

3 結論與討論

苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對小菜蛾、斜紋夜蛾等害蟲具有明顯的拒食、胃毒及抑制生長發(fā)育和生殖力的作用(凌冰等，2008;駱穎等，2012)，這可能與其對代謝酶活性的影響有關。本研究結果表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可顯著抑制亞洲玉米螟幼蟲體內海藻糖酶活性，同時，對堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶活性也有明顯的抑制作用，且隨著苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度的增加和處理時間的延長其抑制作用逐漸增強。海藻糖酶在昆蟲的能量代謝、生長發(fā)育及生殖腺和生殖細胞發(fā)育等方面起重要作用(Selvisabhanayakam，et al.，1993;鐘國華等，2000)。磷酸酯酶(包括堿性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶)不僅在昆蟲體內核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝中起重要作用，而且對外源化合物的解毒代謝也起著重要作用(徐艷聆等，2007)。昆蟲體內海藻糖酶和磷酸酯酶活性受到抑制，將破壞昆蟲正常生理功能，導致昆蟲生理代謝紊亂，生長發(fā)育受阻。因此，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對海藻糖酶和磷酸酯酶活性的抑制作用可能與其毒殺和抑制昆蟲生長發(fā)育作用有關。另外，本研究結果表明，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對羧酸酯酶活性的影響是隨處理時間而變化的，表現為先抑制，后逐步被激活、再恢復的變化過程。周瓊等(2011)用環(huán)氧蒼耳素I 處理菜青蟲后，其中腸羧酸酯酶的活性也表現出先抑制后升高的現象。羧酸酯酶是昆蟲體內一類重要的解毒酶系，不同植物次生物質對昆蟲羧酸酯酶活性的影響是不同的。張愛萍等(2008)報道用0.01-1.0 mg/mL 槲皮素對B 型煙粉虱羧酸酯酶活性有明顯的誘導作用，而0.1-0.5 mg/mL的2-十三烷酮和0.75-30.00 mg/mL葫蘆素B 則表現出明顯的抑制作用，這表明不同植物次生物質對昆蟲羧酸酯酶同工酶組成的影響是不同的?？喙先~乙酸乙酯萃取物進入亞洲玉米螟體內后先抑制了羧酸酯酶活性，從而抑制了昆蟲的正常生理代謝。隨著亞洲玉米螟取食時間的延長進入其體內的苦瓜葉乙酸乙酯萃取物濃度不斷提高，由于解毒功能的需要，部分羧酸酯酶同工酶被誘導激活。這可能是亞洲玉米螟對外界刺激的一種適應機制。

表1 苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對亞洲玉米螟谷胱甘肽-S-轉移酶活性的影響Table 1 Effect of the ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves on GSH-S-transferase specific activity in larvae of Ostrinia furnacalis

谷胱甘肽-S-轉移酶是昆蟲體內重要的解毒代謝酶，對外源化合物的解毒代謝起著重要作用(謝苗和尤民生，2011)。已有的研究表明，植物次生物質可誘導昆蟲谷胱甘肽-S-轉移酶的活性(董向麗等，1998;董鈞鋒等，2002;呂敏等，2012)，可能與昆蟲與植物的長期協同進化有關，一方面植物會分泌有毒植物次生物質來抵御昆蟲的侵害，另一方面，植食性昆蟲為了應對植物的化學防御，其體內的解毒酶系活性同時被誘導，從而增強了昆蟲對植物次生物質的解毒作用，使昆蟲免受次生物質的影響(Després et al.，2007;Piskorski et al.，2011)。我們的研究結果顯示，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對谷胱甘肽-S-轉移酶有顯著的誘導作用，并表現出明顯的劑量效應關系，說明谷胱甘肽-S-轉移酶在對苦瓜葉乙酸乙酯萃取物的解毒過程中發(fā)揮重要作用。

本研究表明，苦瓜乙酸乙酯萃取物可顯著抑制亞洲玉米螟幼蟲體內海藻糖酶活性，說明該酶有可能是其的作用靶標之一。鑒于哺乳動物體內不存在內源性的海藻糖，許多科學家認為研究和開發(fā)以海藻糖酶為靶標的新型殺蟲劑將成為今后的新方向(鐘國華等，2000;楊艷等，2005;王軍娥和劉靜，2009;于彩虹等，2011)。目前，我們已從苦瓜葉乙酸乙酯萃取物中分離得到具有生物活性的momordicin I、momordicin II、3β，7β，25-trihydroxy-cucurbita-5，23-dien-19-al 和3β，7β，25-trihydroxycucurbita-5，23-dien-19-al-3-O-β-D-glucopyranoside 等化合物，有關這些化合物對昆蟲海藻糖酶及相關代謝酶的作用機理有待研究。本研究為進一步了解和揭示這些活性物質的作用機制奠定了基礎。

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