柏大蚜蜜露中可培養(yǎng)細(xì)菌的季節(jié)變化動態(tài)

王鴻艷，南小寧，王云果，魏 琮，賀 虹*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊陵 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

蚜蟲是典型的植食性昆蟲，是農(nóng)林業(yè)主要的刺吸性害蟲之一，它不僅通過吸食樹木的汁液影響其生長，而且其排泄的蜜露可誘發(fā)煤污病和其他林木病害，對農(nóng)作物和林木的生長環(huán)境造成很大的危害。同時，蚜蟲分泌的蜜露中含有豐富的糖類、氨基酸等碳水化合物，是自然界中螞蟻的重要食物資源 (Buckley，1987;Fischer et al.，2002)，也被一些天敵昆蟲如瓢蟲、小蜂等利用進(jìn)行補(bǔ)充營養(yǎng)，并成為這些天敵昆蟲搜尋寄主的信息物質(zhì)(陸宴輝等，2005)。Leroy et al.(2011)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蜜露中特殊的微生物揮發(fā)出的信息物質(zhì)能引誘和增加天敵昆蟲對蚜蟲的寄生效率。此外，蚜蟲體內(nèi)普遍存在內(nèi)共生細(xì)菌Buchnera和次級內(nèi)共生菌(secondary symbionts) (Douglas，1998;Haynes et al.，2003;Baumann，2005)，這些細(xì)菌是否也有可能存在于蜜露中，然后隨之傳播到其他取食蜜露的昆蟲體內(nèi)?因此，為了了解蚜蟲蜜露中微生物的分布情況，作者以柏大蚜Cinara tujafilina (del Guercio)為例，連續(xù)收集了7個月的蜜露樣品，采用微生物分離培養(yǎng)與16S rRNA 基因片段測序相結(jié)合的手段，進(jìn)行了柏大蚜蜜露中細(xì)菌的種類組成和多樣性研究，并初步探討了這些細(xì)菌可能的來源和功能。

1 材料與方法

1.1 柏大蚜蜜露的采集

分別于2011年7-10月和2012年4-6月，于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)校園內(nèi)側(cè)柏林中，利用高枝剪剪取側(cè)柏枝條，檢查其上柏大蚜的分布狀況，并將感染有柏大蚜的側(cè)柏枝條帶回室內(nèi)養(yǎng)蟲室。首先，利用毛筆先將枝條上的柏大蚜移入滅菌的培養(yǎng)皿中;然后將側(cè)柏枝條先用自來水沖洗，然后再浸于滅菌水中沖洗三遍，盡量清洗干凈枝條上的灰塵，晾干水分后將側(cè)柏枝條插入盛有無菌水的三角瓶中，重新將柏大蚜接于枝條上;三角瓶口外圍套上20 cm×20 cm的滅菌鋁箔紙，使蜜露掉落其上，然后用滅菌的大頭針和小槍頭吸取蜜露置于1.5 mL 離心管中(預(yù)先稱重)，根據(jù)蜜露量連續(xù)收集2-3 d，稱重后直接稀釋用于細(xì)菌培養(yǎng)。養(yǎng)蟲室提前經(jīng)過消毒處理，減少室內(nèi)空氣中微生物的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜜露細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化

每月將收集的0.05 g 新鮮蜜露用500μL 無菌水稀釋成原液，并按幾何梯度稀釋至10-8。取原液、不同梯度稀釋液各100μL 涂布接種于LB 培養(yǎng)基平板上，各梯度分別做3個重復(fù)，用無菌水涂布3個平板，作為陰性對照。同時每天將3個干凈的LB 培養(yǎng)基平板置于收集蚜蟲蜜露樣品處，暴露于空氣中5 min，作為陽性對照以檢測實(shí)驗(yàn)室空氣中存在的細(xì)菌。將所有接種和空氣對照的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱(28℃±1℃)中，培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)在30-300個之間、無蔓延菌落生長的平板進(jìn)行菌落計數(shù)。通過肉眼觀察比較菌落形態(tài)特征(包括菌落形狀、大小、色澤、光澤、濕潤度、透明度、隆起狀況、邊緣狀況、表面狀況等)，初步確定不同的細(xì)菌種類后，進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分離純化。使用固體斜面培養(yǎng)基對不同菌種進(jìn)行劃線培養(yǎng)，置于4℃保存。

1.2.2 菌落PCR

分別挑取分離純化的細(xì)菌單菌落，用10μL的無菌水稀釋成菌懸液作為模板，以16S rRNA 基因通用引物27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R (5'-ATGGGYTACCTTGTTACG ACTT-3')進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 (Weisburg et al.，1991)。PCR 反應(yīng)體系包括:TaKaRa Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5μL，10×PCR 反應(yīng)液(Mg2+free)2.5μL，dNTP 混合液 (2.5 mM)2μL，MgCl2(25 mM)1.5μL，引物(10μM)各1μL，模板2μL，用滅菌ddH2O 補(bǔ)足25μL。反應(yīng)程序包括:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行25個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，當(dāng)達(dá)到測序的濃度和純度后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。每種形態(tài)的菌落至少挑取2個進(jìn)行測序分析。

對于不能擴(kuò)增出PCR 產(chǎn)物以及PCR 產(chǎn)物無法滿足測序要求的菌株，通過嘗試以下3 種方法進(jìn)行多次試驗(yàn)至獲得可用的PCR 產(chǎn)物:(1)將菌懸液煮沸后作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增;(2)多次劃線培養(yǎng)，挑取單菌落重新制成菌懸液作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增;(3)挑取單菌落置于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、220 rpm 振蕩培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)3-5次反復(fù)凍融后，用細(xì)菌基因組DNA 試劑盒提取DNA，作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如上所述。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.1 序列的處理及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用軟件ChromasPro 1.5 和Lasergene 7 對原始序列進(jìn)行拼接和校對，并切除首尾亂序。將校對后的序列在GenBank NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對并下載同源性最高的序列，整理后的序列在ClustalX 2.1 軟件(Larkin et al.，2007)中進(jìn)行多重比對，比對結(jié)果在MEGA 5.05 (Tamura et al.，2011)中檢測出最理想的建樹模型，然后構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(Maxium Likelihood)，并結(jié)合Ribosomal Database Project 數(shù)據(jù)庫 (http://rdp.cme.msu.edu/)確定細(xì)菌的分類地位，依據(jù)細(xì)菌97%的序列相似性作為判定種類的標(biāo)準(zhǔn)。本研究分離得到的細(xì)菌16S rRNA 基因序列已經(jīng)全部上傳 GenBank，序列號分別為 KC170346-KC170365 (7月份蜜露樣品)和KC810822-KC810841 (其他月份)。

1.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用α 多樣性指數(shù)(Hill et al.，2003)分析柏大蚜蜜露中可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

Shannon-Wiener 指數(shù)的計算公式為:

式中:S為一個樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌屬水平上的總數(shù);ni為第i個屬的細(xì)菌菌落數(shù);N為可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)。

Simpson 指數(shù)的計算公式為:

均勻度(Evenness)指數(shù)的計算公式為:

Margalef 物種豐富度指數(shù)的計算公式為:

2 結(jié)果與分析

2.1 柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量變化

柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量及變化趨勢如圖1 所示。采用稀釋平板法計算出蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化范圍為7.9× 102-4.9×105CFU/g，跨3個數(shù)量級，變化幅度較大，平均值為9.04×104CFU/g。蜜露樣品中的細(xì)菌數(shù)量在2011年7月達(dá)到最大值，8月蜜露樣品中的細(xì)菌數(shù)量大幅降低，9月又出現(xiàn)一個小高峰;2012年4-6月蜜露樣品中的細(xì)菌數(shù)量整體處于較低水平，6月數(shù)量最低。

圖1 不同月份柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量變化Fig.1 Quantity change of culturable bacteria in honeydew samples of Cinara tujafilina

2.2 柏大蚜蜜露中可培養(yǎng)細(xì)菌的種類組成

從7個月的蜜露樣品中，共分離到73個菌落表型差異的菌株，對其16S rRNA 基因序列的NCBI比對結(jié)果顯示這些菌株隸屬于4 門25 屬的細(xì)菌(表1)。其中，21.9% (16/73)的菌株為芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌，13.7% (10/73)菌株為不動桿菌屬Acinetobacter。此外，2011年8月的蜜露樣品中細(xì)菌種類最多，包括10個屬的細(xì)菌，2012年5月的蜜露樣品中細(xì)菌種類最少，僅包括3個屬的細(xì)菌。其中在柏大蚜蜜露樣品中發(fā)現(xiàn)的庫克菌屬Kocuria、壤球菌 屬 Agrococcus、微球菌 屬M(fèi)icrococcus 和短小桿菌屬Curtobacterium 在空氣對照中也檢測到。

就菌落數(shù)量而言，柏大蚜蜜露中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌群隨著蜜露采集季節(jié)的變化而發(fā)生變化(表1)。2011年7月，優(yōu)勢菌群為土壤桿菌Agrobacterium 和不動桿菌Acinetobacter，分別占該月 總菌落數(shù)的 36.1% (13/36) 和 30.6%(11/36);8月為土壤桿菌Agrobacterium 和莫拉氏菌Moraxella，分別占70% (91/130)和15.4%(20/130);9月為短小桿菌Curtobacterium，占97.1%(331/341);10月為葡萄球菌Staphylococcus，占50% (6/12);2012年4月，優(yōu)勢菌群為短小桿菌Curtobacterium 和芽孢桿菌Bacillus，分別占67% (506/755)和31.4% (237/755);5月為節(jié)細(xì)菌Arthrobacter 和芽孢桿菌Bacillus，分別占53.9% (41/76)和44.7%(34/76);6月為細(xì)桿菌Microbacterium，占61.1% (11/18)。其中，土壤桿菌Agrobacterium、短小桿菌Curtobacterium 和芽孢桿菌Bacillus的細(xì)菌在不同月份的蜜露樣品中都表現(xiàn)出明顯的數(shù)量優(yōu)勢。說明柏大蚜蜜露樣品中細(xì)菌種類隨著時間和外界的條件而發(fā)生變化。

就各屬細(xì)菌在不同蜜露樣品中的分布而言，芽孢桿菌屬Bacillus 細(xì)菌在蜜露樣品中最常出現(xiàn)，在4個月的樣品中都有發(fā)現(xiàn);其次為鏈霉菌Streptomyces、短小桿菌Curtobacterium、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas 和不動桿菌Acinetobacter 在3個月的樣品中都有發(fā)現(xiàn)。

2.3 柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析

不同月份柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性指數(shù)見表2。Shannon-Wiener 指數(shù)(H')大小為7月＞10月＞6月＞8月＞5月＞4月＞9月，Simpson 指數(shù)(D)大小為7月＞10月＞6月＞5月＞8月＞4月＞9月，表明2011年7月、10月和6月的蜜露樣品中的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性較高，2012年4月和2011年9月的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性較低。從Evenness 指數(shù)(E)指數(shù)可以看出，10月＞7月＞6月＞5月＞8月＞4月＞9月，表明2011年10月蜜露樣品中的可培養(yǎng)細(xì)菌種類分布最均勻。就Margalef 物種豐富度(dMa)來看，7月＞8月＞6月＞10月＞9月＞4月＞5月，2011年7月蜜露樣品中的細(xì)菌種群類多，物種最豐富。

總之，由豐富度和細(xì)菌種類的不均勻性共同導(dǎo)致多樣性的高低起伏變化。2011年夏秋季節(jié)蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性變化的規(guī)律性不明顯而且波動幅度較大，多樣性指數(shù)H' 和D的大小分別為:7月＞10月＞8月＞9月。2012年采集的3個樣品(4月、5月和6月)中細(xì)菌多樣性指數(shù)波動幅度相對較小，多樣性水平隨時間的推移而逐漸升高。

表2 柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的物種多樣性Table 2 Species diversity of bacterial strains in honeydew samples of Cinara tujafilina

2.4 柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

從7個月的蜜露樣品中，共分離到73個菌落表型差異的菌株，序列相似性比對結(jié)果表明這些菌株分屬于25個屬的細(xì)菌。選取代表菌株的序列和從Genbank 中下載的與其最相似的序列構(gòu)建了最大似然ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。從ML 系統(tǒng)樹中可以看出，所有菌株構(gòu)成6個分支。變形菌門Proteobacteria的細(xì)菌比重最大，占 71.2%(52/73)，又分為3個分支:其中α-變形菌綱Alphaproteobacteria 和 γ-變形菌 綱Gammaproteobacteria 分別占23.3% (17/73)，各含6個屬，β-變形菌綱Betaproteobacteria 分支中僅包含代爾夫特菌屬Delftia的1 株細(xì)菌。變形菌門的細(xì)菌主要集中在2011年7月和8月收集的蜜露樣品中，占變形菌門所有細(xì)菌的86.5%(45/52)。厚壁菌門Firmicutes 占27.4%(20/73)，包括5個屬。放線菌門Actinobacteria 分支占23.3%(17/73)，包含6個屬。此外，擬桿菌門Bacteroidetes的黃桿菌Flavobacterium 形成一個單獨(dú)分支。

圖3 柏大蚜蜜露樣品可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis for 16S rRNA sequences of cultured bacteria in honeydew samples of Cinara tujafilina

3 結(jié)論與討論

蚜蟲蜜露中細(xì)菌數(shù)量在不同月份表現(xiàn)出明顯差異，這可能與蚜蟲及其寄主植物所處的溫濕度條件有關(guān)(表3)。蜜露樣品中細(xì)菌數(shù)量在2011年7月達(dá)到最大值，可能是由于當(dāng)時氣溫較高、濕度較大，蚜蟲營養(yǎng)條件適合，同時也適合細(xì)菌的繁殖;8月高溫干旱，來源于植物內(nèi)生菌的數(shù)量可能降低;進(jìn)入10月，溫度降低，不適合于細(xì)菌繁殖;2012年6月與2011年8月氣候條件相似，高溫干旱可能導(dǎo)致植物內(nèi)生菌的數(shù)量降低，從而間接影響了蜜露細(xì)菌的數(shù)量。

表3 蜜露收集月份的氣象統(tǒng)計數(shù)據(jù)Table 3 Weather statistics of honeydew collected months

柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性變化動態(tài)也與采樣季節(jié)密切相關(guān)，總體來說，由于2011年夏秋蜜露樣品中細(xì)菌的多樣性變化的規(guī)律性不明顯而且波動幅度大，多樣性指數(shù)為7月＞10月＞8月＞9月;在2012年春季4月、5月和6月收集的3個蜜露樣品中，細(xì)菌多樣性指數(shù)變化幅度也相對較小，且隨時間的推移而逐漸升高。

本研究從2011年7-10月和2012年4-6月共7個月所收集的柏大蚜蜜露樣品中共分離出25個屬的細(xì)菌。對于柏大蚜蜜露細(xì)菌種類的組成而言，不同月份收集的蜜露樣品中細(xì)菌種類、優(yōu)勢菌種、群落結(jié)構(gòu)都有很大差異。

無論在菌落數(shù)量、還是菌株數(shù)量季節(jié)分布來看，芽孢桿菌Bacillus 都是柏大蚜蜜露樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢類群。芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧生活的革蘭氏陽性細(xì)菌，營養(yǎng)要求不高，生活能力強(qiáng)，該菌在不利的環(huán)境中可以形成芽孢將自己保護(hù)起來，復(fù)活率高，因而在自然界中廣泛分布于土壤、空氣等環(huán)境(于雅瓊等，2007)。此外，芽孢桿菌屬的細(xì)菌也是馬尾松(歐陽革成和張潤杰，2005)、鵝掌楸(夏杰等，2009)、銀杏(朱士茂，2011)等多種植物的內(nèi)生菌，并在多種昆蟲體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有該屬細(xì)菌的存在，如桑肩星天牛 Apriona germari (張偉等，2004)、黃粉蟲Tenebrio molitor (張麗等，2006)、豆天蛾Clanis bilineata tsingtauica 幼蟲(呂飛等，2009)、甘薯粉虱Bemesia tabaci (Ateyyat et al.，2010)、桔二叉蚜Toxoptera aurantii (Sevim et al.，2012)等，但尚未有報道指出芽孢桿菌屬的細(xì)菌存在于側(cè)柏或柏大蚜體內(nèi)。芽孢桿菌能夠分泌脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶等多種微生物酶，因而能夠降解甘油三酯、淀粉、蛋白質(zhì)、木聚糖、果膠等高分子物質(zhì)，尤其對植物性的碳水化合物具有較強(qiáng)的降解能力(于雅瓊等，2007)。柏大蚜取食的是側(cè)柏枝條韌皮部和木質(zhì)部中的汁液，它會將植物汁液中多余的碳水化合物排出體外而形成蜜露，該屬細(xì)菌對蜜露中的碳水化合物可能同樣具有降解作用。

短小桿菌屬Curtobacterium的細(xì)菌在2011年9月、10月及2012年4月的柏大蚜蜜露樣品中均有發(fā)現(xiàn)，并且在9月和4月的蜜露樣品中該屬細(xì)菌在菌落數(shù)量上都占有較大優(yōu)勢(表1)，其菌落數(shù)加起來占所有可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)的61.3%(838/1368)。短小桿菌常出現(xiàn)于植物、土壤和油田，其中萎蔫短小桿菌C.flaccumfaciens 是常見的植物致病菌(車秀珠和蔡妙英，2001)。短小桿菌屬在柑橘罹病植株(李顏方等，2011)、黃瓜初花期葉片(孫占斌等，2012)中都是優(yōu)勢的內(nèi)生菌群。在黑粉蟲Tenebrio obscurus 和黃粉蟲T.molitor(張麗等，2006)、六斑異瓢蟲Aiolocaria mirabilis(孟祥杰等，2008)、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis (賀新華等，2010)的腸道中也有發(fā)現(xiàn)。本次分離到的短小桿菌屬細(xì)菌可能源于側(cè)柏或蚜蟲體內(nèi)。

不動桿菌Acinetobacter 在2011年7月、10月及2012年4月的柏大蚜蜜露樣品中都有發(fā)現(xiàn)，且是7月蜜露樣品中的優(yōu)勢菌之一。該屬中的乙酸鈣不動桿菌 A.calcoaceticus 曾在豌豆蚜Acyythosiphon pisum 蜜露中分離到(Leroy et al.，2011)。蜜露中的其他細(xì)菌在自然界中也很普遍，如，根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens 被列為十大細(xì)菌性植物病原菌之一，它能引起冠癭病(Mansfield et al.，2012);鞘氨醇單胞菌Sphingomonas 也在自然界中廣泛分布，已經(jīng)從多種水陸環(huán)境中得到分離，并在昆蟲腸道中也有發(fā)現(xiàn)(Wenzel et al.，2002)?？傊@些從蜜露中分離到的細(xì)菌是否廣泛存在于其他蚜蟲蜜露中，對于蜜露的降解以及其他生物尤其是天敵昆蟲的影響有待于進(jìn)一步的研究。

在野外收集蜜露比較困難，因此我們選擇在室內(nèi)進(jìn)行蜜露收集。在蜜露收集過程中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室消毒、采集工具高壓滅菌處理，對于蚜蟲所取食的側(cè)柏枝條也用無菌水多次沖洗，盡量排除實(shí)驗(yàn)室人為污染。同時，作者認(rèn)為蚜蟲寄主植物微生物對蜜露的組成所構(gòu)成的“污染”也是蜜露細(xì)菌組成的一個合理部分，因?yàn)樵谝巴庋料x蜜露也會受到來源于空氣、蚜蟲寄主植物及蚜蟲體表微生物的污染。此外，也不能排除來源于植物或者空氣中的某些細(xì)菌在蜜露中大量富集，而對蚜蟲天敵產(chǎn)生影響的可能性。Stavrinides 等(2009)證明了豌豆蚜取食被附生細(xì)菌侵占的植物時，順帶也攝取到細(xì)菌，細(xì)菌在其消化系統(tǒng)內(nèi)寄生和大量繁殖，并通過蚜蟲蜜露排出體外，結(jié)果導(dǎo)致接種的葉片上附生細(xì)菌的數(shù)量急劇上升。

在本次試驗(yàn)中我們沒有檢測到蚜蟲中普遍存在的內(nèi)共生菌，這可能是因?yàn)槔ハx的內(nèi)共生菌分離需要更為嚴(yán)格的培養(yǎng)要求。此外，在本實(shí)驗(yàn)中為了便于菌落計數(shù)和初步了解蜜露中細(xì)菌的組成情況，我們僅僅選擇了細(xì)菌常用的LB 培養(yǎng)基進(jìn)行了分析，而不同的培養(yǎng)基和不同的培養(yǎng)條件會分離到更多的細(xì)菌種類，這都有待于進(jìn)一步的深入研究。

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