煙草類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因的克隆及功能研究

史艷梅，王燃，楊軍，羅朝鵬，李鋒，武明珠，魏春陽，林福呈，屈凌波，魏攀

1 鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南省鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號 450001;

2 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南省鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001;

3 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號 450001

生物技術(shù)

煙草類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因的克隆及功能研究

史艷梅1,2，王燃2，楊軍2，羅朝鵬2，李鋒2，武明珠2，魏春陽2，林福呈2，屈凌波1,3，魏攀2

1 鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南省鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號 450001;

2 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南省鄭州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001;

3 河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號 450001

為進(jìn)一步研究煙草類胡蘿卜素異構(gòu)酶（Carotenoid isomerase，CRTISO）基因的功能，從普通煙草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因編碼區(qū)（CDS）全長，長度為1716 bp，Blast結(jié)果顯示與馬鈴薯（Solanum tuberosum）和番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄紅素異構(gòu)酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度達(dá)93%。將CRTISO基因的部分序列插入煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）載體中，構(gòu)建重組載體pTRV2-CRTISO。通過TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）系統(tǒng)抑制本氏煙草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表達(dá)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測CRTISO下游基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，與對照組相比，pTRV-CRTISO載體侵染的煙草葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)；CRTISO基因的沉默導(dǎo)致下游番茄紅素ε環(huán)化酶（ε-LCY）、番茄紅素β環(huán)化酶（β-LCY）和胡蘿卜素β-環(huán)羥化酶（β-OHase）基因表達(dá)量降低。對煙草CRTISO基因功能的研究有助于揭示煙草中類胡蘿卜素合成代謝途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制，為選育優(yōu)質(zhì)煙草品種奠定理論基礎(chǔ)。

普通煙草；類胡蘿卜素異構(gòu)酶；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；病毒誘導(dǎo)的基因沉默

類胡蘿卜素合成代謝途徑在高等植物中扮演重要角色[1]。該途徑的中間代謝產(chǎn)物，如β-胡蘿卜素、黃體素等參與植物的光合作用[2]；終產(chǎn)物包括脫落酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯等，與植物抗氧化和生長發(fā)育相關(guān)[3]。煙草中的類胡蘿卜素屬于萜烯類化合物，其含量的高低能夠影響煙葉的外觀和內(nèi)在品質(zhì)，它不僅與調(diào)制后煙葉的顏色有關(guān)，而且其降解和熱裂解產(chǎn)物包含近百種香氣物質(zhì)，與煙葉的香氣有密切關(guān)系[4]。因此，煙草類胡蘿卜素的研究在國內(nèi)外煙草行業(yè)中始終是焦點(diǎn)，而煙草作為一種重要的模式植物，也為研究提供了良好的材料。1993年，Misawa等將細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶基因（crtⅠ）轉(zhuǎn)入煙草，使其過量表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草中β-胡蘿卜素的累積量明顯提高[5]。2000年，Mann等將煙草中β-胡蘿卜素酮酶基因（crt0）過表達(dá)，使蝦青素等酮基類胡蘿卜素在煙草中不斷累積，最終使花蜜腺的顏色由黃變紅[6]。

CRTISO基因是植物中類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因之一，它催化多反式番茄紅素形成多順式番茄紅素，該基因表達(dá)量降低能夠?qū)е娄?胡蘿卜素大量積累[7]。然而煙草中關(guān)于該基因的研究甚少，我們只能從其它植物的CRTISO基因的研究中獲取一些有價(jià)值的信息。Kato等發(fā)現(xiàn)柑橘中CRTISO基因下調(diào)能夠使果實(shí)中β-胡蘿卜素含量提高，證實(shí)了該基因與β-胡蘿卜素的合成代謝相關(guān)[8]。陶能國等克隆了紐荷爾臍橙的CRTISO基因，該基因與擬南芥、番茄和柑橘的CRTISO基因高度相似，可以推測紐荷爾臍橙的CRTISO基因也與β-胡蘿卜素的合成累積有密切關(guān)系[9]。

本研究從普通煙草中克隆CRTISO基因，并對該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行研究，旨在揭示該基因在煙草類胡蘿卜素合成通路中的作用，為通過基因工程手段培育優(yōu)良煙草品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

普通煙草紅花大金元和本氏煙草由鄭州煙草研究院國家煙草基因研究中心于溫室中栽培。普通煙草的培養(yǎng)條件為（27 ±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，RH（60±2）%；本氏煙草的栽培條件為（23±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，RH（60±2）%。

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、LA Taq酶、DH5α、pMDR19-T Simple Vector、DL2000 DNA Marker和 SYBR Green均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；Trans5K DNA Marker和PCR試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純；引物合成及測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

取普通煙草紅花大金元的植株葉片，液氮研磨成粉，Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

參考NCBI網(wǎng)站上番茄和馬鈴薯的前番茄紅素異構(gòu)酶基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)上游引物CRTISO-F：5’-ATGGCGTTGAGGTTTCAACCTTTT TC-3’；下游引物CRTISO-R：5’-TCATATCCCTA CAGCATCAAGAAGCTG-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 CRTISO基因CDS全長的克隆

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse transcription system說明書將提取的煙草RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，然后用CRTISO的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，模板2 μL，上下游引物各2.5 μL（10 μM），dNTPs 4 μL（10 μM），10×Buffer 5 μL，LA Taq酶0.5 μL，無菌水33.5 μL。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。PCR反應(yīng)條件為94℃，3 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，1.5 min，35 cycles；72℃，10 min；4℃，pause。

用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后與pMDR19-T Simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上培養(yǎng)，挑選白色菌落，PCR驗(yàn)證陽性克隆，陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 pTRV2-CRTISO重組載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

以測序正確的CRTISO基因?yàn)槟０?，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增CRTISO關(guān)鍵區(qū)域片段的引物。上游引物CRTISOVIGS-F：5’-ATGGTACCGATCTCCTAGCCTTCT TGCTTGC-3’（含KpnⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物CRTISO-VIGS-R：5’-CACTCGAGTGTACTCATTG CTTCGGCGAT-3’（含XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)條件為94℃，3 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72℃，45 s，35 cycles；72℃，10 min；4℃，pause。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，膠回收目的片段。

將膠回收目的片段和pTRV2載體分別使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ酶切后連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證；KpnⅠ、XhoⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。對應(yīng)的陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。然后通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.5 農(nóng)桿菌侵染

由于八氫番茄紅素去飽和酶基因（PDS）具有光保護(hù)作用，其沉默后植物出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，因此以PDS基因作為報(bào)告基因來監(jiān)控pTRV載體的侵染效率。分別挑取pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS和pTRV2-CRTISO菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基（50 mg/L Kan，25 mg/L Rif），28℃過夜活化。將活化后的菌液分別接入同樣的50 mL LB培養(yǎng)基中，再加入10 mM 2-N-嗎啉基乙磺酸（MES）和20 μM乙酰丁香酮（AS），28℃過夜培養(yǎng)。低速離心菌液后，用侵染緩沖液（10 mM MgCl2，10 mM MES，200 μM AS）重懸菌體。使用分光光度計(jì)在600 nm波長下調(diào)整OD值至1.0，室溫靜置3 h后接種。空白對照注射生理鹽水，pTRV1 & pTRV2（TRV）作為陰性對照，pTRV1 & pTRV2-PDS（TRV-PDS）作為陽性對照，pTRV1 & pTRV2-CRTISO（TRV-CRTISO）為實(shí)驗(yàn)組，各菌液按照1:1的比例混合，用無針頭的無菌注射器注入煙草的下位葉片中。

1.2.6 熒光定量PCR

利用SYBR Green染料法在BIO-RAD熒光定量PCR儀上反應(yīng)，同時(shí)選取26S rRNA作為內(nèi)標(biāo)基因，定量分析普通煙草在農(nóng)桿菌侵染后CRTISO及其下游基因的表達(dá)量差異。

熒光定量PCR體系為：1 μL cDNA，10 μL SYBR Green，CRTISO基因上下游引物各1 μL（5 μM），加ddH2O補(bǔ)至20 μL。26S rRNA基因Realtime PCR反應(yīng)體系為：1 μL cDNA，10 μL SYBR Green，26S上 下 游 引 物 各 1 μL（5 μM）， 加ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，20 s，60℃，20 s，40 cycles；4℃，pause。對照組和實(shí)驗(yàn)組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品檢測3次，取3個(gè)Cp值的平均值，用2-△△Cp法計(jì)算。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的檢測

如圖1所示，提取的樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示有28S和18S兩條清晰條帶，RNA無降解；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測OD260/OD280均在1.8～2.0之間，濃度大約為 870 ng/μL。

圖1 RNA電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of RNA

2.2 CRTISO基因CDS的克隆與檢測

以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CRTISO基因的CDS全長序列。如圖2所示，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在1700 bp左右有清晰、特異的條帶。膠回收目的片段，連接到pMDR19-T Simple Vector上進(jìn)行測序，測序結(jié)果為1716 bp。如圖3所示，Blast結(jié)果顯示該序列與馬鈴薯和番茄的前番茄紅素異構(gòu)酶基因的相似度達(dá)93%。上述檢測結(jié)果表明已成功獲得普通煙草CRTISO基因的CDS全長序列。將該基因命名為NtCRTISO，并上傳基因序列至GenBank，登錄號為KJ909512。

圖2 CRTISO的PCR電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis result of CRTISO

圖3 CRTISO的Blast結(jié)果Fig 3 The Blast result of CRTISO

2.3 pTRV2-CRTISO重組載體的檢測

以重組質(zhì)粒pTRV2-CRTISO為模板，使用上下游引物CRTISO-VIGS-F & -R擴(kuò)增CRTISO基因的關(guān)鍵區(qū)域片段。如圖4所示，在600 bp左右有清晰的特異性條帶。

圖4 CRTISO-VIGS片段的PCR電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of CRTISO-VIGS

使用KpnⅠ、XhoⅠ對重組質(zhì)粒pTRV2-CRTISO進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果顯示在600 bp左右有清晰的特異性條帶（圖5）。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定的陽性質(zhì)粒送公司測序，結(jié)果顯示插入的目的片段長度為638 bp，表明pTRV2-CRTISO重組載體構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒pTRV2-CRTISO雙酶切電泳結(jié)果Fig.5 Agarose gel electrophoresis result of double digestion pTRV2-CRTISO

2.4 農(nóng)桿菌侵染

如圖6所示，pTRV-PDS農(nóng)桿菌侵染10天后，新煙葉出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，表明煙草的PDS基因被成功沉默，TRV載體的侵染效率很高。

圖6 pTRV-PDS光漂白效應(yīng)Fig.6 pTRV-PDS photobleaching in leaves

如圖7所示，農(nóng)桿菌侵染35天后，與空白對照和陰性對照相比，侵染pTRV-CRTISO的煙草葉片產(chǎn)生黃色斑塊，表明CRTISO基因被沉默后產(chǎn)生了較明顯的表型。

圖7 農(nóng)桿菌侵染本氏煙草35天表型示意圖Fig.7 Phenotypes comparison between infected pTRV-CRTISO and controls

2.5 CRTISO基因沉默后對下游基因的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測農(nóng)桿菌侵染后CRTISO基因的沉默效果，以及CRTISO下游基因的表達(dá)量變化。

如圖8所示，與空白對照組（Control）相比，侵染pTRV-CRTISO農(nóng)桿菌之后，CRTISO基因的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），而陰性對照與空白對照之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果表明CRTISO基因被有效地沉默。

圖8 農(nóng)桿菌侵染后CRTISO基因的Real-time PCR結(jié)果Fig.8 Expression levels of CRTISO after infiltration of pTRVCRTISO

如圖9～11所示，CRTISO基因沉默后，導(dǎo)致其下游基因ε-LCY、β-LCY和β-OHase的表達(dá)量降低（P＜0.05）。

圖9 ε-LCY基因的Real-time PCR結(jié)果Fig.9 Expression levels of ε-LCY after infiltration

3 討論

15-順式-八氫番茄紅素是類胡蘿卜素合成途徑中的第一個(gè)成分，它在八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）的催化下生成ζ-胡蘿卜素，隨后被ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）脫氫生成順式番茄紅素。類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）就是在此將順式番茄紅素（前番茄紅素）催化生成全反式番茄紅素，然后在番茄紅素ε-和β-兩種環(huán)化酶的作用下生成α-和β-胡蘿卜素，再經(jīng)過胡蘿卜素β-環(huán)羥化酶（β-OHase）催化，最終分別生成葉黃素（Lutein）和新黃質(zhì)（Neoxanthin）[10]。

圖10 β-LCY基因的Real-time PCR結(jié)果Fig.10 Expression levels of β-LCY after infiltration

圖11 β-OHase基因的Real-time PCR結(jié)果Fig.11 Expression levels of β-OHase after infiltration

類胡蘿卜素是影響煙葉品質(zhì)的重要成分之一，能夠決定調(diào)制后煙葉的顏色。它的降解產(chǎn)物香氣好，刺激性小，是影響煙葉香氣質(zhì)量的主要組分[11]。近期的研究還表明類胡蘿卜素能夠提高光合效率，抑制并清除自由基[12]，這對煙葉品質(zhì)的改善和降低煙氣中自由基的傷害具有重要意義。因此，提高煙葉中類胡蘿卜素的含量不僅能夠提高煙葉的品質(zhì)，還可以改善烤煙的香氣風(fēng)味。

本研究發(fā)現(xiàn)普通煙草的CRTISO基因沉默后，類胡蘿卜素合成通路下游的基因ε-LCY、β-LCY和β-OHase的表達(dá)量降低，煙葉上開始出現(xiàn)黃色斑塊，然而煙草本身似乎并未受到嚴(yán)重傷害。新鮮煙葉中的植物色素主要包括葉綠素、β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，而β-OHase負(fù)責(zé)催化α-和β-胡蘿卜素的降解，該基因表達(dá)量的降低抑制了胡蘿卜素降解反應(yīng)的進(jìn)行，可能會導(dǎo)致煙草中胡蘿卜素的累積，使煙葉顏色發(fā)生改變。這為進(jìn)一步研究煙草類胡蘿卜素合成代謝途徑中各基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

綜上所述，由于類胡蘿卜素在煙葉中的轉(zhuǎn)化、積累和降解與煙葉的品質(zhì)和香氣密切相關(guān)，而類胡蘿卜素的合成代謝受光照、溫度和遺傳等多種因素的調(diào)節(jié)[13]，因此通過分子手段選育類胡蘿卜素含量高的優(yōu)良煙草品種將是我們今后深入研究的方向。

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Cloning and functional analysis ofCRTISOgene inNicotiana tabacum

SHI Yanmei1,2,WANG Ran2,YANG Jun2,LUO Zhaopeng2,LI Feng2,WU Mingzhu2,WEI Chunyang2,LIN Fucheng2,QU Lingbo1,3,WEI Pan2
1.College of Chemistry and Molecular Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;
2.Zhengzhou Tobacco Research Institute,China National Tobacco Corporation,Zhengzhou 450001,China;
3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China

CDS of carotenoid isomerase (CRTISO1716 bp) was obtained from cDNA ofNicotianatabacumby PCR to explore function ofCRTISO.Blast results showed that this gene shared 93% identities withSolanumtuberosumandSolanumlycopersicum.Key nucleotide sequence ofCRTISOwas inserted into tobacco rattle virus (TRV) vector and recombinant pTRV2-CRTISO vector was constructed.Expression level ofCRTISOwas suppressed through VIGS system.Plants infiltrated with pTRV-CRTISO grew abnormal leaves which had yellow patches.Results of Real-time PCR showed that the expression level of ε-LCY,β-LCYandβ-OHasewas depressed due to silence ofCRTISO.Findings of this study may contribute to further research in carotenoid biosynthesis and help to lay theoretical foundation for tobacco breeding.

Nicotianatabacum; CRTISO; Real-time PCR; VIGS

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.022

Q81 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）06-0138-06

鄭州煙草研究院科技項(xiàng)目“煙草類胡蘿卜素含量的遺傳調(diào)控和材料驗(yàn)證”（092013CZ0620）; 鄭州煙草研究院院長科技發(fā)展基金項(xiàng)目“普通煙草紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的克隆和功能分析”（902012CA0120）

史艷梅（1985—），在讀博士研究生，主要從事煙草基因功能研究，Tel：0371-67672076，Email：symzgh@163.com

魏 攀（1983—），博士研究生，工程師，主要從事煙草分子生物學(xué)研究，Tel：0371-67672073，Email：weipan83@126.com

2014-03-01