胞漿輕鏈測定在多發(fā)性骨髓瘤的微小殘留病變檢測中的價(jià)值

朱 杰，高艷飛

（1.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116027；2.遼河油田第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 盤錦12400）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性惡性漿細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）在骨髓中異常增殖，并伴有單克隆免疫球蛋白（monoclonal immunoglobulin）增多為特征的疾病，多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為骨髓瘤細(xì)胞增生、浸潤和破壞骨組織及髓外其他組織，出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、貧血、出血，以及骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白而出現(xiàn)感染、高鈣血癥、腎臟病變、高粘滯血癥、淀粉樣變等。經(jīng)典的化療方案緩解率低，隨著新藥問世、聯(lián)合化療和骨髓造血干細(xì)胞移植等新技術(shù)的應(yīng)用，MM患者的緩解率不斷提高。近年來研究表明，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析有助于MM診斷，緩解后患者體內(nèi)MRD分析是判斷療效和預(yù)后的重要指標(biāo)，目前國內(nèi)有關(guān)MRD的報(bào)道多是應(yīng)用于骨髓瘤細(xì)胞的膜表面免疫表型。本研究應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行胞漿輕鏈的測定來建立MRD分析方案，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

樣本來源：選取2010年1月至2012年11月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院確診MM患者中經(jīng)化療后完全緩解病例45例，其中女性12例，男性33例，中位年齡60歲；初診骨髓細(xì)胞學(xué)檢查瘤細(xì)胞占（15－95%），其中分泌型為37例（IgG型為27例，IgA型為10例）輕鏈型為5例（λ鏈型4例，κ鏈型1例），不分泌型3例，其完全緩解后形態(tài)學(xué)及血清學(xué)均為陰性。

1.2 儀器

流式細(xì)胞儀：FACSCalibur美國BD公司。

1.3 試劑

CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、 CD138－PE、CD45－APC、κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、κ－FITC／λ－PE、IgG2a－FITC、IgG1－PE，溶 血 素、破 膜劑，以上試劑均購自美國BD公司。

1.4 標(biāo)本的采集

無菌操作抽取0.2ml骨髓液涂片作顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查。另抽取2ml置于EDTA－K2抗凝血常規(guī)管作微小殘留病變檢測，48h內(nèi)完成檢驗(yàn)。

1.5 標(biāo)本的處理

骨髓涂片行瑞氏－吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并分類計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞?？鼓墓撬枰簂 ml，加3 ml PBS液，混勻后，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)，調(diào)節(jié)至5×106／ml，制成細(xì)胞懸液備用。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 胞膜的標(biāo)記及胞漿內(nèi)輕鏈的標(biāo)記

①胞膜的標(biāo)記：每管100μl細(xì)胞懸液分別加入（IgG2a－FITC、IgG1－PE、CD45－APC）、（CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、CD45－APC）、 （CD138－PE、CD45－APC）、（κ－FITC／λ－PE／CD19－Percp、CD45－APC）各20μl，混勻避光15min，加配置好的溶血素2ml，避光10min，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

②胞漿內(nèi)輕鏈的標(biāo)記：取兩只試管，每管100μl細(xì)胞懸液分別加入CD45－APC 20μl，避光15min，再加入破膜劑A液100μl，避光10min，加溶血素2 ml，避光10min，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加入破膜劑B液50μl，分別加 入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE）、（κ－FITC／λ－PE），避光15min，加2ml PBS洗滌，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

1.6.2 流式細(xì)胞儀測定 用熒光微球校準(zhǔn)儀器及補(bǔ)償后，用Cellquset軟件收取200000－400000個(gè)細(xì)胞，通過CD45／SSC和CD38／CD56聯(lián)合設(shè)門，確定瘤細(xì)胞的位置及抗原表達(dá)情況。

1.6.3 MRD分析 以胞漿κ／λ抗體為核心，組合CD38、CD56、CDl9、CD45、CD138進(jìn)行四色 MRD分析。根據(jù)此前的免疫分型，本研究設(shè)計(jì)了以下2種瘤細(xì)胞的免疫組合：CD19－CD38＋CD56＋CD45－CD138＋和CD19－CD38＋CD56－CD45－CD138＋，來尋找漿細(xì)胞的位置，最后根據(jù)異常胞漿κ／λ的表達(dá)，來確定MRD的陽性率，其目的主要是排除正常漿細(xì)胞和其他有核細(xì)胞干擾。結(jié)果判斷：目標(biāo)細(xì)胞異常輕鏈表達(dá)＞0.1%[1－4]，即為 MRD陽性。

1.6.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS11.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)應(yīng)兩組應(yīng)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 45例形態(tài)學(xué)及血清學(xué)完全緩解的多發(fā)性骨髓瘤患者確診前免疫表型及胞漿輕鏈表達(dá)見表1，其中免疫表型為CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－主要見于輕鏈型和不分泌型。

2.2 兩種免疫表型的 MRD陽性率見表2，其中CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－的MRD的陽性率明顯高于CD38＋CD56＋CD138＋CD19－CD45－，兩者比較P＜0.05。

2.3 兩種胞漿輕鏈的MRD陽性率見表3，兩者比較無顯著性差異，P＞0.05。

2.4 45例MM患者緩解后進(jìn)行MRD檢測，其中14例MRD陽性，31例MRD陰性。對(duì)此45例患者進(jìn)行隨訪，病例隨訪時(shí)間最長為24個(gè)月，最短為2個(gè)月。MRD陰性組4例復(fù)發(fā)（13%），MRD陽性組10例復(fù)發(fā)（71%），兩組復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。MRD陰性組的累積無病生存時(shí)間中位數(shù)為15.53（9.35－21.62）個(gè)月，明顯長于 MRD陽性組的9.75（3.69－14.24）個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。結(jié)果見表4。

表1 45例多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞確診時(shí)免疫表型及胞漿輕鏈的表達(dá)

表2 不同免疫表型骨髓瘤的MDR的陽性率

表3 不同胞漿輕鏈型骨髓瘤的MDR的陽性率

表4 不同MDR表現(xiàn)的復(fù)發(fā)率和生存期

3 討論

MM傳統(tǒng)意義上CR患者體內(nèi)仍殘留約1010個(gè)腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)的根源。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測和血、尿蛋白電泳等方法分析MRD有一定的局限性。形態(tài)學(xué)是最普遍、最基礎(chǔ)的檢測手段，在一定程度上可反映治療的效果。但骨髓瘤細(xì)胞常呈灶狀或斑點(diǎn)狀分布，穿刺部位不同、骨髓稀釋、制片不佳導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞堆積在片尾或邊緣都會(huì)降低瘤細(xì)胞的比例，且形態(tài)學(xué)上不易與正常漿細(xì)胞區(qū)分，也難以反映緩解期內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化，且靈敏度僅能達(dá)到5×10－2水平。血、尿蛋白電泳可間接反映腫瘤負(fù)荷量，但特異性較低，敏感度也不高。我們采用流式細(xì)胞術(shù)研究MM細(xì)胞的免疫表型特征及胞漿輕鏈的表達(dá)，以期建立更好的監(jiān)測MRD的方法，為MM的預(yù)后判斷和個(gè)體化治療提供可靠依據(jù)[5－8]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CD138（Syndecan－1）是漿細(xì)胞特異性抗原，新近歐洲骨髓瘤協(xié)作組（European MyelomaNetwork，EMN）在流式細(xì)胞術(shù)免疫分型方面達(dá)成共識(shí)，推薦 MM分型至少要用CD38、CD138、CD45中的一種抗體識(shí)別漿細(xì)胞，初診設(shè)漿細(xì)胞門要基于CD38／CD138的共表達(dá)（應(yīng)有文獻(xiàn)支持）。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上增加CD56、CD19、胞漿輕鏈（κ／λ）的檢測，在45例的患者中，瘤細(xì)胞的免疫表型為兩種CD38＋CD56＋CD138＋CD19－CD45－和CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－，并且都表達(dá)一種胞漿輕鏈，根據(jù)以上免疫表型，我們利用CD38、CD56、CD138、CD19、CD45來確定漿細(xì)胞的位置，并檢測胞漿內(nèi)輕鏈的含量來確定是否是骨髓瘤細(xì)胞的殘余。這比其他的文獻(xiàn)報(bào)道的僅僅利用漿細(xì)胞的膜表面的標(biāo)志來確定瘤細(xì)胞的含量更加準(zhǔn)確和客觀。利用瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆的胞漿輕鏈的特性，避免把一些正常的漿細(xì)胞記入為瘤細(xì)胞[9－11]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)免疫表型為CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－

的多發(fā)性骨髓瘤患者均為輕鏈型和不分泌型，并且MRD的檢測均為陽性，提示此型的預(yù)后較差，但因收集的標(biāo)本例數(shù)較少，此結(jié)果在今后的工作中收集到更多的標(biāo)本再詳述。

MRD陽性的患者其復(fù)發(fā)率高于陰性的患者，而生存期短于陰性的患者，這就為臨床監(jiān)測和治療骨髓瘤疾病提供了可靠的依據(jù)。對(duì)于處于完全緩解期的骨髓瘤患者，如果發(fā)現(xiàn)MRD陽性，應(yīng)該鞏固治療，以期望 MRD轉(zhuǎn)為陰性，來獲得更好的療效[12，13]。

對(duì)于骨髓瘤MRD的檢測，我們認(rèn)為初診時(shí)應(yīng)全面分析MM患者免疫表型和胞漿輕鏈，特別是對(duì)一些輕鏈型和不分泌型的骨髓瘤患者，檢測胞漿輕鏈顯得尤為重要，這樣才能為以后的MRD檢測提供更可靠的依據(jù)。

盡管高劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植已經(jīng)可以使多數(shù)MM患者達(dá)到完全緩解，但復(fù)發(fā)仍是臨床影響患者生存期的主要問題。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)是目前敏感性和特異性都很高的檢測MRD的方法[14，15]。應(yīng)用四色免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)，CD45－APC／SSC及 CD38／CD56／CD19 及 CD138聯(lián)合設(shè)門，通過檢測胞漿內(nèi)輕鏈（cκ鏈、cλ鏈）對(duì)多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病變監(jiān)測以及臨床判斷預(yù)后具有重要價(jià)值，并對(duì)臨床開展相關(guān)治療具有指導(dǎo)意義。

[1]陳葆國，羅文達(dá)，李伯利，等.多發(fā)性骨髓瘤流式細(xì)胞術(shù)免疫表型及微量殘留病研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34：10.

[2]張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1998：373.

[3]J Pefetti V，Viguarelli MC，Palladini G，et al.Insights into the regulation of immunoglobulin light chain gene rearrangements via analysis of thekappa light chain locus in lambda myeloma[J].Immunology，2004，112：420.

[4]古 建，肖 平，陳焯文.微小殘留病灶監(jiān)測在多發(fā)性骨髓瘤的臨床預(yù)后應(yīng)用[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2012，12（7）：848.

[5]Rawstron AC，Orfao A，Beksac M，et a1.Report of the European Myeloma Network on muhiparametric flow cyt0metry in muhiple myeloma andrelated disorders[J].Haematologica，2008，93：431.

[6]Gupta R，Bhaskar A，Kumar L，et a1.Flow Cytometric Immunophenotyping and Minimal Residual Disease Analysis in Multiple Myeloma.Am JClin Pathol，2009，132：728.

[7]J Lin P，Owens R，Tricot G，et a1.Flow Cytometrie immunophenotypic analysis of306cases ofmultiple myeloma[J].Am J Clin Pathol，2004，121：482.

[8]Cumova J，Kovarova L，Potacova A，et a1.Optimization of immunomagnetic selection of myeloma cells from bone marrow using magnetic activatedcell sorting[J].Int J Hematol，2010，92：314.

[9]秦 燕，丁潤生，陸 偉.多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的價(jià)值[J].交通醫(yī)學(xué)，2009，23（2）：137.

[10]李金蘭，劉艷榮，常 艷.多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型特點(diǎn)[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2002，10（3）：226.

[11]Rawstron AC，OrfaoA，BeksacM，et a1.Report ofthe European－Myeloma Network on muhiparametric flow cometry in multiplemyeloma and related disorders[J].Haematologiea，2008，93：431.

[12]Gupta R，Bhaskar A，Kumar L，et a1.Flow CytomemcImmunophenotyping an d Minimal Residual Disease Analysis inMultiple Myeloma[J].Am J Clin Pathol，2009，l32：728.

[13]Carlo－Stella C，Guidetti A，Dinicola M，et a1.CD52antigenexpressed by malign an t plasma cells can be targeted byalemtuzumab in vitro in NOD／SCID mice[J].Exp Hematol，2006，34：721.

[14]龐 妍，李 力，鄺麗萍，等.多發(fā)性骨髓瘤免疫表型研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2011，19（6）：1518.

[15]朱永梅，陳賽娟.微小殘留病檢測方法及其臨床應(yīng)用[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005，13（6）：1131.