連接蛋白Cx43參與冠狀動脈平滑肌細胞的異質(zhì)性促進冠脈再狹窄

張旭敏，馬曉燁，王小東，姚義安

（同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院 心內(nèi)科，上海200120）

血管平滑細胞增殖及從中膜向內(nèi)膜遷移是動脈粥樣斑塊演變和支架術(shù)后再狹窄形成的基本過程[1]，其中內(nèi)皮細胞損傷是再狹窄始動因素[2]，血管平滑肌細胞的增值、遷移、凋亡及細胞外基質(zhì)合成降解是病理基礎(chǔ)。已有實驗證實血管壁平滑肌細胞具有異質(zhì)，當(dāng)血管受到損傷后，釋放炎癥因子誘導(dǎo)血管中層特定種類平滑肌細胞遷移并聚集在血管內(nèi)膜[3]，增殖并分泌細胞外基質(zhì)，并促進新生內(nèi)膜形成參與血管重建[4]；血管平滑肌細胞遷移是動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)以及冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄等臨床常見血管病變共同病理基礎(chǔ)[5，6]，因此對于平滑肌細胞遷移機制的深入研究對于更好治療血管疾病及預(yù)防冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄有重要意義。

縫隙連接是相鄰的細胞間進行離子及小信號分子傳導(dǎo)交換通道，它幾乎存在于哺乳動物所有組織和細胞中，每一個通道、連接蛋白都有獨特的成分[7]，血管結(jié)構(gòu)中可檢測4種連接蛋白即：Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，其分布主要取決于血管大小、血管樹部位及動物種屬[8]；平滑肌細胞主要表達Cx43，有些平滑肌細胞表達Cx40，通過這些蛋白完成細胞間信息溝通[9]。已有實驗觀察到在鼠動脈硬化生長階段血管內(nèi)膜Cx43表達增加[10]，減少Cx43表達限制動脈粥樣硬化發(fā)展[11]。但目前有關(guān)Cx43在支架術(shù)后再狹窄中的作用尚不明確。

1 材料與方法

1.1 主要材料 超低溫冰箱（日本SANYO公司）、細胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）、20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司、）PCR儀（Applied Biosystems 7900HT Fast Real－Time PCR System）、投射電鏡 （日本olympus公司）、光鏡（日本olympus公司）、胰酶（Gibco公司）、Cx40、Cx43、S100A4、α－SMA二抗山羊抗兔抗體，action二抗山羊抗小鼠抗體，均為Abcam公司生產(chǎn)，其他試劑均為國產(chǎn)。

1.2 血管平滑肌細胞培養(yǎng)

根據(jù)同濟大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，將3月齡家豬雌雄不限，動物來源于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動物實驗室，隨機于前降支，回旋支或右冠狀動脈血管置入裸支架一枚（微創(chuàng)Firebird），經(jīng)1月后再次行冠狀動脈造影證實再狹窄的麻醉后處死，取狹窄段冠狀動脈，用冷D－Hanks液沖洗后放在另一玻璃平皿上，用眼科剪沿血管縱向剖開，用手術(shù)刀片背面輕輕刮除內(nèi)皮層，取動脈中膜層，采用組織貼壁法培養(yǎng)冠狀動脈中層平滑肌行原代細胞培養(yǎng)，正常3月家豬未經(jīng)任何處理為對照組處死，分離冠狀動脈前降支、回旋支、右冠狀動脈，縱形破開分離出中層，進行原代細胞培養(yǎng)；2組平滑肌細胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）培養(yǎng)，加入20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司）放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3d換1次液。

1.3 正常冠脈平滑肌細胞PDGF誘導(dǎo)

經(jīng)原代培養(yǎng)正常冠脈平滑肌細胞在細胞培養(yǎng)基（DMEM，美國GIBCO公司）培養(yǎng)，20%的胎牛血清（FCS，美國GIBCO公司），將貼壁90%細胞用胰酶消化1min后，依次鋪入六孔板內(nèi)，24h貼壁牢固后，加入 PDGF－BB （10ng／mL，Roche）共同培育，PDGF－BB濃度為10ng／mL[12]，作用24h；電鏡，光鏡觀察細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化；PCR測定連接蛋白表達；然后加入連接蛋白阻斷劑（18－a＿glycyrrhetinic acid濃度100μmol／L）[12]，阻斷作用48h，后分別在24h、48h電鏡觀察細胞結(jié)構(gòu)變化及連接蛋白變化。實驗分為3組：正常對照組；誘導(dǎo)組：PDGF－BB（10 ng／ml）；阻斷組：PDFG－BB（10ng／ml）＋Cx43阻斷劑（100μmol／L）。各組細胞培養(yǎng)24h后收集用于以下各項指標(biāo)檢測。

1.4 光鏡觀察冠脈大體標(biāo)本

冠狀動脈大體標(biāo)本，分為正常及支架組蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察血管壁厚度及細胞形態(tài)。

1.5 電鏡觀察SMC細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)

離心收集貼壁細胞，2.5%戊二醛固定2－3h，1%娥酸固定2－3h，脫水臨界點干燥，包埋、固化，超薄切片機切片50－60nm，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，投射電鏡（日本olympus公司）觀察平滑肌細胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.6 實時熒光定量PCR測定Cx43、Cx40mRNA的表達

Trizol一步法抽提正常組及支架組冠狀動脈平滑肌細胞RNA。測定總RNA純度、濃度及RNA完整性的檢測，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及cDNA合成（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。放入熒光定量PCR 儀 （Applied Biosystems 7900HT Fast Real－Time PCR System），反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動進行溶解曲線分析，并計算得到每個樣本的ct值，以GAPDH為內(nèi)參照，計算得到目的基因mRNA的含量。

1.7 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計采用均數(shù)±（SD），應(yīng)用Prism Version 5.0軟件（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA），方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 豬冠狀動脈細胞原代培養(yǎng)

正常冠狀動脈平滑肌細胞胰酶消化后分離，光鏡下可見兩種形態(tài)：紡錘型（spindle－shaped，SSMC）和長菱形（rhomboid，R－SMC），紡錘型細胞呈現(xiàn)谷峰生長模式，長菱形呈單層生長趨勢，同文獻所描述[1]，而在支架植入再狹窄組分離類長菱形為主，見圖1。

圖1 正常R－SMC 正常S－SMC 支架組原代細胞

2.2 正常冠狀動脈平滑肌細胞經(jīng)PDGF誘導(dǎo)后細胞形態(tài)

在本實驗中證實誘導(dǎo)豬冠狀動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)變與 Li[13]報道相同。

圖2 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

圖3 正常組X400 支架組X400

圖4 正常10000X 支架術(shù)后10000X

如圖加入10ng／mLPDGF－BB后，細胞增殖加速，抑制分化。故誘導(dǎo)組可以看出細胞核仁復(fù)制分裂，但是細胞膜分裂還未完成；當(dāng)加入100μmol／LCX43阻斷劑后，又抑制細胞分裂，見圖2。

2.3 支架植入后

血管內(nèi)膜明顯增厚，光鏡觀察血管中層以RSMC細胞為主，免疫熒光檢測Cx43表達明顯增加，見圖3。

透射電鏡下見正常冠狀動脈平滑肌細胞呈梭狀形態(tài)，核呈鋸齒狀，胞漿內(nèi)含平滑肌細胞特征性結(jié)構(gòu)肌絲和密體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，游離核糖體豐富，并含有大量高爾基體。支架組的冠狀動脈平滑肌細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)有大的空泡狀結(jié)構(gòu)，且體內(nèi)也有少量凋亡小體出現(xiàn)，細胞器線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等相對于正常組數(shù)量減少，見圖4。

2.4 連接蛋白表達變化

正常冠狀動脈平滑肌細胞Cx40表達為主，Cx43少量表達，當(dāng)加入PDGF共同培育后可見細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且細胞蛋白表達發(fā)生變化，誘導(dǎo)后以Cx43表達為主，Cx40少量表達，與Christos E[14]報道相同。支架植入術(shù)后Cx43表達增多，見圖5，6。

圖5 PDGF－BB誘導(dǎo)及阻斷Realtime PCR圖

圖6 支架植入術(shù)Realtime PCR圖

3 討論

冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄是血管損傷反應(yīng)引起新生內(nèi)膜增生與血管重塑的過程，正常血管平滑肌位于血管中層，周圍被基質(zhì)所包繞，基質(zhì)與平滑肌接觸從而發(fā)揮生物屏障和機械屏障作用，使平滑肌處于收縮型，限制其移動。在此研究中分離正常豬冠狀動脈平滑肌細胞，體外顯示兩種不同類型：紡錘型（spindle－shaped，S－SMC）和長菱形（rhomboid，RSMC），以S－SMC占比率較高，R－SMC比率較少。當(dāng)血管損傷后釋放各種細胞因子、組織因子和炎癥介質(zhì)，在以上因素作用下中膜平滑肌細胞激活，發(fā)生表型改變，由收縮型變?yōu)楹铣尚停罅糠置诩毎饣|(zhì)，細胞外基質(zhì)增加促進平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移、增值[12]；血小板源性生長因子（PDGF）是一種炎性因子，它可與細胞膜上PDGF受體結(jié)合，可促進細胞有絲分裂，我們將體外正常組平滑肌細胞經(jīng)PDGF－BB誘導(dǎo)，使S－SMC變?yōu)镽－SMC，同時伴有Cx43表達上調(diào)，過反義RNA降低Cx43表達，這種變化受抑制，S－SMC平滑肌細胞保持原有形態(tài)，同時表達a－肌動蛋白。因此，體外證實Cx43表達與平滑肌細胞表型及細胞增殖密切相關(guān)。

本實驗成功制造冠狀動脈支架植入術(shù)后再狹窄模型，狹窄的冠狀動脈，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜明顯較正常組增厚，在增厚內(nèi)膜可見R－SMC占高比率，SSMC幾乎很少，同時伴大量巨噬細胞，細胞培養(yǎng)RSMC比S－SMC有更強增值、遷移能力，同時與正常組比通過PCR檢測Cx43表達明顯增加，因此Cx43參與動脈損傷后修復(fù)和再狹窄過程。血管平滑肌細胞遷移、增值是血管重塑啟動階段重要的細胞學(xué)基礎(chǔ)，是冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄主要原因[15]。

關(guān)于連接蛋白與再狹窄相關(guān)性研究主要涉及平滑肌細胞，在此研究中觀察豬冠狀動脈平滑肌細胞表型變化與連接蛋白變化相關(guān)性，我們觀察到細胞表型與文獻報導(dǎo)人主動脈細胞類型相類似[16]。我們研究從體外細胞培養(yǎng)后應(yīng)用PDGF誘導(dǎo)，以及體內(nèi)通過支架再狹窄后細胞形態(tài)研究均提示連接蛋白Cx43表達與平滑肌細胞表型變化和遷移密切相關(guān)。雖然目前機制尚不清楚，但是以連接蛋白Cx43為目標(biāo)靶向治療可能成為預(yù)防再狹窄新起點。

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