GDNF基因誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促周圍神經(jīng)再生的實驗研究

尚修超，顧加祥，張乃臣，劉宏君，田 恒，潘俊博

（1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州225001；2.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇 揚州225001）

周圍神經(jīng)損傷是臨床常見病癥，損傷后如不進(jìn)行及時有效的修復(fù)，損傷神經(jīng)支配區(qū)肌肉必將萎縮，造成神經(jīng)肌肉功能障礙，給后續(xù)康復(fù)帶來不利的影響［1］。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF），是一種有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的分化、發(fā)育、生長和存活具有重要作用［2］。BMSCs經(jīng)GDNF基因誘導(dǎo)后可分化為神經(jīng)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)損傷模型中可顯著促進(jìn)損傷神經(jīng)再生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SD大鼠均由揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房提供，DAPI福建邁新，HPIAS－1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)，電子天平，冰凍切片機(jī)，掃描電鏡，

1.2 建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型

大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定。碘伏消毒皮膚，作左大腿切口，約3cm，鈍性分離皮下，沿股后外側(cè)肌間隙鈍性分離到腘窩上緣顯露坐骨神經(jīng)約20mm，輕輕游離，于坐骨神經(jīng)梨狀肌下緣5mm持針器咬合三齒十次，將坐骨神經(jīng)夾傷達(dá)透明薄紙狀，8－0普里林顯微縫線標(biāo)記坐骨神經(jīng)夾傷兩端，大鼠左下肢反應(yīng)遲鈍，屈伸力量大大減弱，達(dá)到造模目的。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每日肌注適量抗生素。

1.3 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）與腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率

術(shù)后4周、8周觀察以下指標(biāo)：①選擇印跡清晰的足印分別測量正常足和傷足三個指標(biāo)：足跡長度（PL）：足尖到足跟的最大距離；足趾寬度（TS）：第1－5趾的距離；中間足趾寬度（TT）：第2－4趾的距離。②坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）＝－38.3［（EPLNPL）/NPL］＋109.5［（ETS－NTS）/NTS］］＋13.3［（EIT－NIT）/NIT］－8.8。其中坐骨神經(jīng)指數(shù)值為0～－11%表示神經(jīng)功能完全正常，－100%表示神經(jīng)功能完全喪失，－11%～－100%表示部分神經(jīng)功能恢復(fù)。③腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率（%）＝手術(shù)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量/對側(cè)正常腓腸肌濕質(zhì)量×100%。

1.4 BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

將大鼠置于75%的酒精中消毒5min。無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，并剪去兩端，用5ml注射器抽取DMEN培養(yǎng)基5ml反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗液緩慢置于離心管中，2 500r/min離心20 min，收集中間單層細(xì)胞，PBS沖洗2次，應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3ml重新懸浮細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，置于室溫、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。24h后更換新培養(yǎng)液去除非貼壁細(xì)胞，以后每隔3d換液一次。當(dāng)1012d時，細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)板孔90% ，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，3－4d傳代一次。鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

BMSCs經(jīng)三代體外傳代培養(yǎng)后，接種在無菌的6孔培養(yǎng)板中，達(dá)到80%融合時進(jìn)行BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)實驗。細(xì)胞換液后行載GDNF基因的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)兩周，于室溫、5%CO2、飽和濕度培育箱內(nèi)孵育，每3d全量換液一次，連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 BMSCs注入大鼠損傷再生室模型

微量注射器將等量濃縮細(xì)胞打入坐骨神經(jīng)再生室模型。對照組：未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs；實驗組：GDNF基因誘導(dǎo)后的BMSCs。微量注射器注入完成后，將切口縫合，繼續(xù)飼養(yǎng)8周。

1.6 腓腸肌冰凍切片DAPI染色

每組大鼠腓腸肌組織做一套切片，切好的組織粘附于防脫片上，晾干，DAPI染色10min，晾干后，中性樹脂封片，鏡下觀察切片結(jié)果。

1.7 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析

坐骨神經(jīng)行Marsland和LFB染色，黑色的軸突和藍(lán)色的髓鞘在病理圖文自動分析系統(tǒng)放大600倍下測量各組坐骨神經(jīng)損傷段再生有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目、軸突直徑和再生髓鞘厚度結(jié)果。

1.8 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察

術(shù)后8周取各組坐骨神經(jīng)于損傷標(biāo)記8－0普里林邊緣切下，2.5%戊二醛固定，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預(yù)冷的1% 鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。系列梯度酒精（50%、70% 、80%、90%、100%）脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15min。乙酸戊酯：乙醇為1∶1中通過一次30min，純戊酯通過30min，CO2臨界點干燥，粘樣噴金上鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計分析

SFI和腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率結(jié)果采用方差分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS15.0。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率和SFI檢測

術(shù)后4和8周分別測量每組的SFI和腓腸肌濕重恢復(fù)率，結(jié)果如下。

表1 術(shù)后各組大鼠腓腸肌濕重恢復(fù)率比較（±s，n＝10，%）

表1 術(shù)后各組大鼠腓腸肌濕重恢復(fù)率比較（±s，n＝10，%）

＊P0.01， 。

8w對照組術(shù)后4w 術(shù)后27.800±0.128 12.500±0.111實驗組 35.202±0.027＊ 32.600±0.017＊

表2 術(shù)后各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）比較（±s，n＝10，%）

表2 術(shù)后各組大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）比較（±s，n＝10，%）

＊P＜0.01，有顯著差異。

8w對照組術(shù)后4w 術(shù)后－91.46±1.36 －80.24±2.24實驗組 －87.02±1.81 －73.00±2.51＊

圖1 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果（實驗組）

通過表1可以看出，實驗組可顯著延緩大鼠腓腸肌濕質(zhì)量減少速度，其恢復(fù)率情況明顯優(yōu)于對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01）。由表2可知，術(shù)后4周四組大鼠SFI恢復(fù)情況無明顯差異，但術(shù)后8周，實驗組的SFI恢復(fù)情況明顯優(yōu)于對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01）。

2.2 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果

400倍鏡下觀察可見實驗組（圖1）較未誘導(dǎo)對照組（圖2）細(xì)胞核更多，而對照組腓腸肌萎縮明顯。

圖2 腓腸肌冰凍切片DAPI染色結(jié)果（對照組）

2.3 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果

GDNF基因誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)對照組相比，GDNF基因誘導(dǎo)組再生神經(jīng)纖維計數(shù)、軸突直徑和髓鞘厚度大于未誘導(dǎo)對照組（見表3），差異有顯著性意義（P＜0.01）。

表3 再生神經(jīng)纖維病理圖像分析（±s）

表3 再生神經(jīng)纖維病理圖像分析（±s）

＊P＜0.01

組別 軸突直徑（μm） 髓鞘厚度（μ㎡） 有髓神經(jīng)纖維計數(shù)（根）2.14±0.15 0.99±0.12 65.54±5.01實驗組 3.21±0.08＊ 1.63±0.11＊ 86.54±5.50對照組＊

圖3 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果（實驗組）

圖4 坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析結(jié)果（對照組）

實驗組（圖3）神經(jīng)纖維數(shù)、軸突直徑和髓鞘厚度明顯大于對照組（圖4），且排列更加整齊。

2.4 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡下觀察實驗組（圖5）可見明顯高放電神經(jīng)絲交聯(lián)，比對照組（圖6）神經(jīng)再生更加明顯。

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line－derivedneurot rophic factor，GDNF），對多巴胺能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元等多種神經(jīng)元均具有促存活及損傷保護(hù)作用，對感覺神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，因此其可應(yīng)用于神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療［4－7］。

圖5 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果（實驗組）

圖6 坐骨神經(jīng)切面掃描電鏡觀察結(jié)果（對照組）

通過DAPI染色，GDNF基因誘導(dǎo)組較未誘導(dǎo)對照組細(xì)胞核更多，并且未誘導(dǎo)對照組腓腸肌萎縮更加明顯。在坐骨神經(jīng)再生神經(jīng)纖維分析中，GDNF基因誘導(dǎo)組坐骨神經(jīng)損傷段再生有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目、軸突直徑和再生髓鞘厚度明顯增加，并且排列比較整齊。掃描電子顯微鏡下，GDNF基因誘導(dǎo)組有明顯高放電神經(jīng)絲交聯(lián)，神經(jīng)再生更加明顯。GDNF基因誘導(dǎo)組可顯著延緩大鼠腓腸肌濕質(zhì)量減少速度。術(shù)后8周，GDNF基因誘導(dǎo)組的SFI恢復(fù)情況明顯優(yōu)于對照組。由上述結(jié)果可知，經(jīng)GDNF基因誘導(dǎo)BMSCs組各方面檢測指標(biāo)均較對照組為好，其中誘導(dǎo)后實驗組掃描電鏡下觀察周圍神經(jīng)再生更加明顯。因此，GDNF基因誘導(dǎo)的間充干細(xì)胞對周圍神經(jīng)再生有著顯著的療效。

DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，它能粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)。DAPI作為一種能與DNA分子特異結(jié)合的熒光染料，無明顯細(xì)胞毒性，可穿透活細(xì)胞胞膜，所以它可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。DAPI標(biāo)記細(xì)胞由于操作簡便，被標(biāo)記細(xì)胞的生命活動無明顯影響，可直接觀察，費用低廉，因此得到廣泛使用。DAPI未導(dǎo)致細(xì)胞死亡和沒有破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。細(xì)胞的彈性模量的變化受各種生理、病理以及外界物理、化學(xué)、生物等因子刺激的影響，其中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)動力學(xué)變化以及骨架重排對細(xì)胞彈性影響最顯著。DAPI穿透活細(xì)胞膜與DNA特異結(jié)合沒有影響細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，所以DAPI染色對細(xì)胞的彈性模量沒有影響，同時可通過DAPI的染色初步區(qū)分出細(xì)胞核大小。因此，本實驗可見GDNF基因誘導(dǎo)組較未誘導(dǎo)對照組細(xì)胞核更多，明顯可見未誘導(dǎo)對照組腓腸肌萎縮明顯。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derivedmesenchymal stem cells，BMSCs），是來源于骨髓的單胚層多能干細(xì)胞，能自我增殖。因其取材容易，能迅速體外培育和增殖，同時具有多向分化潛能，并且避免了倫理方面的沖突。因此，其在組織工程、細(xì)胞移植和基因治療方面有十分廣闊的前景［8－16］。

然而，BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中仍有一些不足之處［17－26］：①沒有BMSCs的特異性標(biāo)記分子，而且沒有標(biāo)準(zhǔn)的分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增和鑒定的方法；②BMSCs可跨胚層分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，有望成為神經(jīng)細(xì)胞替代治療的種子細(xì)胞，但誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的生理功能尚待進(jìn)一步研究；③BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞仍處在實驗研究階段。

同時，在后續(xù)實驗中我們應(yīng)對BMSCs誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)是否含有神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行檢測：①該物質(zhì)是否存在于軸突末梢內(nèi)；②神經(jīng)興奮時該物質(zhì)是否能釋放至突觸間隙，并且作用于突觸后膜上的特異性受體；③神經(jīng)元中是否有合成該物質(zhì)的前體和中間物，是否有合成酶和分解酶；④神經(jīng)末梢內(nèi)是否有對該物質(zhì)迅速滅活的機(jī)制系統(tǒng)；⑤該物質(zhì)作用于突觸后膜時是否能模擬神經(jīng)生理效應(yīng)。

［1］Raheja Amol，Suri Vaishali，Suri Ashish.Dose－dependent facilitation of peripheral nerve regeneration by bone marrow－derived mononuclear cells：a randomized controlled study［J］.Neurosurg，2012，117（6）：1170.

［2］劉 卓，徐 運，黃丹青.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（23）：4227.

［3］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.Neurotrauma，1995，12（1）：1.

［4］Xu Pin，Rosen Kenneth M，Hedstrom Kristian.Nerve injury induces glial cell line－derived neurotrophic factor（gdnf）expression in schwann cells through purinergic signaling and the pkc－pkd pathway［J］.Glia，2013，61（7）：1029.

［5］Decressac Mickael，Kadkhodaei Banafsheh，Mattsson Bengt.α－Synuclein－Induced Down－Regulation of Nurr1Disrupts GDNF Signaling in Nigral Dopamine Neurons［J］.Sci Transl Med，2012，4（163）：156.

［6］Yoo YMi，Lee CJg，Kim YJg.Exogenous GDNF increase the migration of the neural stem cells with no protection against kainic acid－induced excitotoxic cell death in rats［J］.Brain Res，2012，1486：27.

［7］王俊芳，羅永湘，方 煌.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及初步鑒定［J］.實用手外科雜志，2006，20（3）：160.

［8］胡資兵，曾 榮，郭偉韜.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化特征［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（43）：8561.

［9］Miura Yasuo，Yoshioka Satoshi，Yao Hisayuki.Chimerism of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells in allogeneic hematopoietic cell transplantation：Is it clinically relevant？［J］.Chimerism，2013，4（3）：48.

［10］Shuai Hongxia，Zhang Ji.Role of stereotaxically injected IgG from db/db mice in the phosphorylation of the microtubule－associated protein tau in hippocampus［J］.Brain Res，2012，1486：14.

［11］卓本慧，江和碧，瞿 平.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的體外研究［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2005，19（5）：373.

［12］楊乃龍，楊 芬，徐麗麗.共培養(yǎng)法神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（29）：5611.

［13］Kwon C，Kovesdi Erzsebet，Gyorgy B.Stress and traumatic brain injury：a behavioral，proteomics，and histological study［J］.Front Neurol，2012，2（12）：1.

［14］Ciccocioppo Rachele，Bernardo Maria Ester，Sgarella Adele.Autologous bone marrow－derived mesenchymal stromal cells in the treatment of fistulising Crohn＇s disease［J］.Gut，2011，60（6）：788.

［15］Su Guan－Hua，Sun Yu－Fei，Lu Yong－Xin.Hepatocyte growth factor gene－modified bone marrow－derived mesenchymal stem cells transplantation promotes angiogenesis in a rat model of hindlimb ischemia［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33（4）：511.

［16］Hu Weihua，Ye Yaping，Wang Jiang.Bone morphogenetic proteins induce rabbit bone marrow－derived mesenchyme stem cells to differentiate into osteoblasts via BMP signals pathway［J］.Artif Cells Nanomed Biotechnol，2013，41（4）：249.

［17］Quante Michael，Tu Shui Ping，Tomita Hiroyuki.Bone marrow－derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth［J］.Cancer Cell，2011，19（2）：257.

［18］Rosland Gro Vatne，Svendsen Agnete，Torsvik Anja.Long－term cultures of bone marrow－derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation［J］.Cancer Res，2009，69（13）：5331.

［19］王連仲，王永才，聞 華.干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（36）：7193.

［20］Izal Shurah，Aranda Pablo，Sanz－Ramos Patricia.Culture of human bone marrow－derived mesenchymal stem cells on of poly（L－lactic acid）scaffolds：potential application for the tissue engineering of cartilage［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2013，21（8）：1727.

［21］Kim Yang－Soo，Lee Hyo－Jin，Ok Ji－Hoon.Survivorship of implanted bone marrow－derived mesenchymal stem cells in acute rotator cuff tear［J］.J Shoulder Elbow Surg，2013，22（8）：1037.

［22］Guan Jian，Zhu Zhaohui，Zhao Robert Chunhua.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats［J］.Biomaterials，2013，34（24）：5937.

［23］Wu Bo，Ma Xu，Zhu Damu.Lentiviral delivery of biglycan promotes proliferation and increases osteogenic potential of bone marrow－derived mesenchymal stem cells in vitro［J］.J Mol Histol，2013，44（4）：423.

［24］Zaminy Arash，Shokrgozar Mohammad Ali，Sadeghi Yousef.Mesenchymal stem cells as an alternative for schwann cells in rat spinal cord injury［J］.Iran Biomed J，2013，17（3）：113.

［25］Siegel Georg，Kluba Torsten，Hermanutz－Klein Ursula.Phenotype，donor age and gender affect function of human bone marrow－derived mesenchymal stromal cells［J］.BMC Med，2013，11（1）：146.

［26］Huang Chieh－Cheng，Tsai Hung－Wen，Lee Wen－Yu.A translational approach in using cell sheet fragments of autologous bone marrow－derived mesenchymal stem cells for cellular cardiomyoplasty in a porcine model［J］.Biomaterials，2013，34（19）：4582.