二甲亞砜對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能的影響

羅光成，易婷婷，劉素蘭，張國元，張 君，蔣興亮

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 南充637000）

二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）是溶解性極好的有機(jī)溶劑之一，既是科研實(shí)驗(yàn)中配制試劑時(shí)的常用助溶劑，也是目前最好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑。因此，DMSO在科研實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛，但研究表明DMSO本身對(duì)細(xì)胞也存在一定的毒性作用，可能影響細(xì)胞生長和功能［1－3］。外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，是T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的集合體，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用。PBMCs參與眾多疾病的的發(fā)生發(fā)展過程，特別是HIV、HBV、HCV和結(jié)核等感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。因此，在一些疾病的研究過程中，PBMCs也常常作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，或者被長期深低溫保存。然而，在科研實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的DMSO是否對(duì)PBMCs的功能產(chǎn)生影響呢？本研將對(duì)此問題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

抽取5例健康成年人外周血10ml，密度梯度離心法分離獲取PBMCs。分別在含有0.5%、1%、2%、4%、8%DMSO的培養(yǎng)條件下，檢測(cè)PBMCs的增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能。

1.2 主要試劑和儀器

DMSO、PHA、RPMI 1640、淋巴細(xì)胞分離、胎牛血清和牛血清白蛋白購自Sigma公司；Anti－CD3和Anti－CD28購自BD公司；IFN－γELISPOT試劑盒購自BioRad公司；FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀購自BD公司；ELISPOT reader購自BIOSYS公司。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞的分離

采集受試者外周靜脈血10ml，并肝素抗凝；用RPMI1640稀釋至20ml；緩緩加到兩支含5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心2 000rpm×20 min；收集淋巴細(xì)胞分離液上的云霧狀的PBMCs層，并臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以備后續(xù)試驗(yàn)用。

1.4 CFSE染色檢測(cè)PBMCs增殖能力

以活細(xì)胞熒光標(biāo)記物羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（Carboxyl Fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester，CFSE）為細(xì)胞增殖示蹤物，Anti－CD3和 Anti－CD28（Anti－CD3/28）為刺激物，并最終用流式細(xì)胞儀分析PBMCs增殖情況。CFSE染色檢測(cè)細(xì)胞增殖的具體步驟如下：（1）取適量分離到的新鮮PBMCs，用0.1%BSA－PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×107/ml，與等體積4.0μmol/ml的 CFSE混合，37℃避光染色8min。（2）加入等體積的胎牛血清，37℃避光溫育10min，以終止染色反應(yīng)。離心棄上清，再用0.1%BSA－PBS洗滌三次。（3）用含不同濃度DMSO的R10培養(yǎng)基（含90%的RPMI1640和10%的FBS）重懸PBMCs，以2×105的細(xì)胞數(shù)鋪板，并加入刺激物anti－CD3/28，37℃、5%CO2孵育5天。（4）收集細(xì)胞并流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采集到的流式數(shù)據(jù)采用FlowJo分析軟件分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞增殖強(qiáng)度通過軟件自帶的增殖分析工具計(jì)算得出，用Divided%表示。

1.5 ELISPOT檢測(cè)PBMCs細(xì)胞因子分泌功能

該實(shí)驗(yàn)以植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）為刺激物，采用IFN－γELISPOT技術(shù)檢測(cè)PBMCs細(xì)胞因子分泌功能。具體步驟如下：①包被：用PBS稀釋IFN－γ單克隆抗體（1∶1 000），以50μl/孔加入ELISPOT板的微孔中，4℃冰箱過夜。②封閉：棄掉微孔中包被液，用無菌PBS洗滌6次。然后每孔加入200μl R10，室溫封閉60min。③用含不同濃度DMSO的R10將PBMCs重懸PBMCs，并調(diào)至4×106/ml。④棄去封閉液，每培養(yǎng)孔加50μl細(xì)胞懸液和50μl 4μg/ml的PHA，將ELISPOT板于培養(yǎng)箱，37℃5%CO2孵育18－24h，棄培養(yǎng)液并洗滌6次。⑤1∶1000稀釋生物素化的INF－γ多克隆抗體，并每孔加50μl，室溫孵育4h，棄二抗并洗滌6次。⑥1∶1 000稀釋酶標(biāo)親和素，并每孔加50μl，室溫孵育60min，棄酶標(biāo)液并洗滌6次。⑦加顯色液：加入新鮮配制的顯色液100μl/孔，室溫避光顯色15－30min，ELISPOT reader讀板，計(jì)算斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot－forming cells，SFC）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差檢驗(yàn)（least significant difference，LSD），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMSO對(duì)PBMCs增殖功能的影響

采用CFSE染色示蹤PBMCs、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析增殖細(xì)胞比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和表1所示，在含有不同濃度DMSO的培養(yǎng)環(huán)境下，PBMCs具有不同的增殖能力。在含有0.5%、1%的DMSO的培養(yǎng)環(huán)境中，與不含DMSO的對(duì)照組相比，PBMCs的增殖能力無顯著改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在含有2%、4%、8%DMSO的環(huán)境中，PBMCs的增殖能力受到了明顯的抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 DMSO對(duì)PBMCs細(xì)胞因子分泌能力的影響

采用IFN－γELISPOT技術(shù)檢測(cè)DMSO對(duì)PBMCs分泌IFN－γ的影響，結(jié)果顯示：在含有0.5%、1%、2%的DMSO的培養(yǎng)環(huán)境中，PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能無顯著改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在含有4%、8%DMSO的環(huán)境中，PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能受到了明顯的抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，高濃度的DMSO同樣對(duì)PBMCs的細(xì)胞因子分泌功能和增殖能力有著相似影響。如圖2和表1所示。

圖1 DMSO對(duì)PBMCs增殖功能的影響

表1 不同濃度DMSO對(duì)PBMCs的增殖和細(xì)胞因子分泌能力的影響

圖2 DMSO對(duì)PBMCs細(xì)胞因子分泌能力的影響

3 討論

DMSO是科研實(shí)驗(yàn)中常用的助溶有機(jī)化合物和最好的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，關(guān)于它對(duì)不同種類細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長抑制和細(xì)胞毒作用，國內(nèi)外已有一些報(bào)道［1－5］。已有的研究表明DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)與細(xì)胞種類、作用濃度和作用時(shí)間明顯相關(guān)。E－ter等［5］人的研究表明，15.5μl/ml的 DMSO 能明顯抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖；Oz等［1］人報(bào)道，1.4μM/ml的DMSO對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用；Liu等人［2］的研究結(jié)果顯示，2%的DMSO對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞系細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。彭坤等人［4］的研究顯示，10ml/L的DMSO作用48h即可抑制人視網(wǎng)膜色素上皮生長，其抑制作用隨濃度增加和作用時(shí)間延長更加顯著。然而，關(guān)于DMSO對(duì)PBMCs及其細(xì)胞亞群的影響，目前鮮有報(bào)道。在PBMCs的功能研究過程中，其增殖能力和分泌活性細(xì)胞因子的能力是研究者非常關(guān)心的問題。特別是在感染性疾病的研究過程中，IFN－γ因其作為清除感染的效應(yīng)細(xì)胞因子而廣受關(guān)注。

CFSE是一種用于示蹤細(xì)胞增殖過程的活細(xì)胞熒光染料，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)來反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。ELISPOT是一種在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子分泌功能的檢測(cè)技術(shù)。目前，CFSE示蹤技術(shù)和ELISPOT技術(shù)分別是檢測(cè)細(xì)胞增值功能和細(xì)胞因子分泌能力的主要方法之一［6－8］。在Anti－CD3/28和PHA的刺激下，淋巴細(xì)胞可分別發(fā)生增殖和分泌細(xì)胞因子。因此，本文采用CFSE示蹤技術(shù)和IFN－γELISPOT技術(shù)，分別檢測(cè)DMSO對(duì)PBMCs增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能的影響。我們的研究結(jié)果顯示，DMSO在培養(yǎng)體系中的體積分?jǐn)?shù)為2% 時(shí)，PBMCs的增殖功能開始受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而當(dāng)培養(yǎng)體系中的DMSO的濃度為4%時(shí)，PBMCs分泌細(xì)胞因子的功能開始受到明顯抑制，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且，從圖1A和圖2A可以看出，DMSO對(duì)PBMCs增殖和細(xì)胞因子分泌功能的影響存在良好的濃度依賴趨勢(shì)。這與韓大良、葛成等人的研究結(jié)果相似［3，9，10］，韓大良的結(jié)果表明，當(dāng)DMSO濃度大于2%時(shí)，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞的細(xì)胞活力和活細(xì)胞率受到明顯抑制，并且葛成也證明DMSO濃度大于2%就可以對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的活力產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。另外，我們的研究的結(jié)果顯示，DMSO對(duì)PBMCs增殖和細(xì)胞因子分泌功能產(chǎn)生抑制作用的起始濃度是不一致的，分別為2%和4%。這表明，DMSO的細(xì)胞毒性作用不僅在不同細(xì)胞種類之間存在差異，即使在同種細(xì)胞的不同檢測(cè)指標(biāo)之間也有所差異。

綜上所述，當(dāng)培養(yǎng)體系中DMSO濃度大于2%，就會(huì)對(duì)PBMC產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用，且其細(xì)胞毒性作用隨濃度的增加而增加。因此，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有DMSO時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮DMSO濃度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)時(shí)間等因素，參照已有研究結(jié)果并且進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，采取適當(dāng)措施或減小規(guī)避DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

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