晚期結(jié)直腸癌患者DC－CIK免疫干預(yù)前后D二聚體改變的臨床研究

王睿斌，郝筱詩(shī)，齊保聚，任連偉，盛敏佳

（1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 肛腸外科，北京102600；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院2010級(jí)放射1班，長(zhǎng)春130021；

3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，長(zhǎng)春130033）

惡性腫瘤患者往往伴有血液的高凝狀態(tài)，這種高凝狀態(tài)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。化療作為惡性腫瘤有效干預(yù)手段的同時(shí)，可加重這種高凝狀態(tài)甚至形成血栓[1]。近年來(lái)，免疫干預(yù)對(duì)于腫瘤干預(yù)的有效性得到肯定，并且與單細(xì)胞測(cè)序、“普朗克”探測(cè)微波背景輻射、人類連接組計(jì)劃、探索南極冰下世界、基礎(chǔ)植物研究共同被列為2013年人類6大科技任務(wù)之一[2]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于探討DC－CIK免疫干預(yù)對(duì)于晚期結(jié)直腸癌患者凝血功能及D二聚體的影響，進(jìn)一步肯定DC－CIK的有效性及安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011年7月－2012年8月入住我院行DC－CIK免疫干預(yù)的IV期結(jié)直腸癌患者40人，其中男性26例，女性14例（年齡26－85歲），結(jié)腸癌15例，直腸癌25例（見(jiàn)表1）。所有患者在DC－CIK干預(yù)前后1月內(nèi)均未接受放化療?；颊呒捌浞ǘù砣酥椴⑼饨邮茉摳深A(yù)。所有患者在G－CSF動(dòng)員前5天內(nèi)及DC－CIK免疫干預(yù)1個(gè)月后行凝血功能及D二聚體的檢測(cè)。選擇同期體檢的健康成年人43例（年齡31－82歲）行凝血功能及D二聚體檢測(cè)作為對(duì)照。

1.2 主要試劑來(lái)源

G－CSF為日本中外制藥株式會(huì)社產(chǎn)品。干擾素－γ為上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，IL－2為北京四環(huán)生物制藥有限公司產(chǎn)品，CD3單抗為北京同力海源生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品，TNF－α、IL－4、GMCSF為廈門特寶生物股份有限公司產(chǎn)品。纖維蛋白原、凝血酶原時(shí)間、D二聚體檢測(cè)試劑盒均為貝克曼庫(kù)爾特有限公司產(chǎn)品。

1.3 凝血功能及D二聚體的檢測(cè)方法

所有患者在G－CSF動(dòng)員前5天內(nèi)及DC－CIK免疫干預(yù)1個(gè)月后行凝血功能及D二聚體的檢測(cè)。檢測(cè)儀器為TOP全自動(dòng)凝血儀，纖維蛋白原采用纖維蛋白原－C XL試劑盒，凝血酶原采用凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒（凝固法），D二聚體采用D－二聚體測(cè)定試劑盒（免疫比濁法）。

1.4 DC－CIK免疫干預(yù)經(jīng)過(guò)

所有患者經(jīng)骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)無(wú)骨髓轉(zhuǎn)移，骨髓造血功能大致正常，于－2天起予以G－CSF刺激造血，在－1天給予股靜脈留置雙腔ARROW靜脈導(dǎo)管，－1、0、1天給于速碧林0.4ml皮下注射（共3天，分血后拔除股靜脈置管，停止速碧林皮下注射）。當(dāng)外周血白細(xì)胞﹥1×109／L、淋巴＋單核﹥15%后，分兩天采集外周血干細(xì)胞200－250ml。取新鮮血25－50ml行DC－CIK細(xì)胞培養(yǎng)（剩余的－80℃分袋凍存?zhèn)溆茫Ｅ囵B(yǎng)7－10天進(jìn)行細(xì)胞回輸，最低細(xì)胞數(shù)量大于1×108，隔日1次，每周期3次。

1.5 DC－CIK細(xì)胞懸液的制備

取新鮮外周血干細(xì)胞25－50ml用生理鹽水1∶1稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分層液表面上，無(wú)菌封蓋，400g，30min，輕輕吸細(xì)胞層，用生理鹽水1 500 rpm，5min，洗3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，5×106／ml／瓶，將細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基（含2.5%自體血漿的1640培養(yǎng)基）中60－80ml／瓶，3瓶放入5%的CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2－4h。懸浮細(xì)胞進(jìn)行CIK培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞進(jìn)行DC培養(yǎng)。然后檢菌—將細(xì)胞與完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

CIK培養(yǎng)：合并懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液并移入完全培養(yǎng)基（含自體血漿的AIM－V），1LAIM－V培養(yǎng)基中加入各種細(xì)胞因子[干擾素－γ1ml（即全部加到1L AIM－V 中），IL－2 1 200μl，CD3單抗5－10μl并首次加1支肝素]，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

DC培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞加入DC培養(yǎng)基和各種細(xì)胞因子[TNF－α（30μl／30ml），IL－4（60μl／30ml），GMCSF（60μl／30ml）]放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

隔日鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基和細(xì)胞因子（含2.5%自體血漿 AIM－V加補(bǔ)IL－2終濃度1μl／ml）。

回收細(xì)胞后生理鹽水低速離心，洗3次。用適量含有12.5%血漿蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞，回輸患者。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，配對(duì)t檢驗(yàn)，采用SPSS 13.0軟件包分析。

2 結(jié)果

2.1 DC－CIK細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果

所培養(yǎng)的DC和CIK細(xì)胞以1∶3的比例混合，所得細(xì)胞總數(shù)大于1×108，圖1為患者CIK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果圖例。

圖1 某患者CIK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

2.2 晚期結(jié)直腸癌患者凝血功能與健康成年人的比較

所有晚期結(jié)直腸癌患者的D二聚體、FIB、PT%、INR均高于健康成年人（數(shù)據(jù)未顯示）。

40例晚期結(jié)直腸癌患者在DC－CIK免疫干預(yù)1月后D二聚體水平仍高于健康成年人，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)IB、PT%、INR也高于健康成年人，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 40例晚期結(jié)直腸癌患者免疫干預(yù)1月后與健康成年人凝血功能及D二聚體的比較

2.3 DC－CIK免疫干預(yù)前后凝血功能的比較

40例晚期結(jié)直腸癌患者在DC－CIK免疫干預(yù)前后D二聚體水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)IB、APTT、PT%、INR也有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 40例晚期結(jié)直腸癌患者DC－CIK免疫干預(yù)前后凝血功能及D二聚體的變化

3 討論

惡性腫瘤患者往往伴有凝血功能異?！獫{纖維蛋白原增高[3]及D二聚體明顯增高，這與腫瘤高負(fù)荷導(dǎo)致的過(guò)度纖溶有關(guān)[4]。腫瘤患者患靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)是健康人的7倍，而且是該人群的第二大死因[5]，甚至有日本學(xué)者報(bào)道D二聚體可作為晚期結(jié)直腸癌的獨(dú)立不良預(yù)后因素[6]?；熓悄[瘤患者干預(yù)的重要手段，但化療過(guò)程中腫瘤組織壞死產(chǎn)物及毒素對(duì)臨近組織和血管造成損傷，可激活凝血過(guò)程，從而增加靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)[7]，臨床上有待于發(fā)現(xiàn)一種有效并安全的干預(yù)手段。至2009年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了全球第一個(gè)免疫干預(yù)產(chǎn)品以來(lái)，人們對(duì)免疫干預(yù)對(duì)于腫瘤干預(yù)的有效性得到了肯定，我們的研究表明，DC－CIK免疫干預(yù)同時(shí)也可降低晚期結(jié)直腸癌患者D二聚體的水平，降低靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)，和化療相比更安全。

DC細(xì)胞是重要的抗原遞呈細(xì)胞，在介導(dǎo)免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性中起著非常重要的作用。CIK細(xì)胞是非組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞[8]，既具有NK細(xì)胞的非 MHC限制性抗腫瘤作用也具有T細(xì)胞的抗腫瘤活性，抗瘤譜廣。和單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞相比，DC－CIK的抗腫瘤活性更強(qiáng)，增殖速度更快并且凋亡速度更慢，CD3＋CD56＋細(xì)胞比例更高[9.10]，并且對(duì)多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞的療效更好[11]。

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道術(shù)后聯(lián)合DC－CIK、化療聯(lián)合DC－CIK 的有效性[12.13]，任軍等[12]對(duì)比了轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者標(biāo)準(zhǔn)劑量紫杉醇加塞替哌方案化療與大劑量該方案聯(lián)合DC－CIK免疫治療的PFS和OS，結(jié)果顯示DC－CIK組與標(biāo)準(zhǔn)劑量化療組相比，OS延長(zhǎng)17.9個(gè)月（33.1比15.2），PFS延長(zhǎng)6.5個(gè)月（10.2比3.7），差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究旨在探討DC－CIK免疫干預(yù)在有效的同時(shí)對(duì)于凝血功能及D二聚體的影響。結(jié)果表明，干預(yù)后D二聚體明顯下降（P＝0.005），說(shuō)明DC－CIK免疫干預(yù)可大大降低患者的靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)，我們認(rèn)為這與免疫干預(yù)后腫瘤負(fù)荷降低有關(guān)。我們的研究中患者在置管后及每日分血后均給于速碧林0.4ml皮下注射（僅3次），但根據(jù)速碧林的藥代動(dòng)力學(xué)，該藥皮下注射后3小時(shí)血漿濃度達(dá)到高峰，而后5h進(jìn)入半衰期，大約10－12h完全排出體外，故而對(duì)1月后的凝血功能及D二聚體沒(méi)有影響。本研究中干預(yù)后患者的D二聚體水平仍然高于同期體檢的健康成年人（P＝0.03），可能與干預(yù)后仍有一定腫瘤負(fù)荷有關(guān)。另外，干預(yù)前后FIB也有明顯下降，但P＝0.067尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們不排除與樣本量較少對(duì)結(jié)果的影響，隨著研究的樣本量進(jìn)一步擴(kuò)大尚待進(jìn)一步觀察。

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