復(fù)PL乳GA法及其改良法制備的干擾素微球載藥釋藥特性的對(duì)比*

羅宇燕，麥海燕，黎 吶，金啟星，黃小舟，張永明

(1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東廣州 510630;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

干擾素 (interferon，IFN)是一種廣譜抗病毒劑，目前主要用于治療慢性乙肝、丙肝等疾病。作為一種蛋白藥物，其分子量大，半衰期短，體內(nèi)外穩(wěn)定性差，臨床上主要的劑型是溶液型注射劑和凍干粉針。注射給藥后，藥物很快就被清除或降解，為了達(dá)到療效常常需要頻繁、大劑量及長時(shí)間給藥，導(dǎo)致毒副作用及耐受性的產(chǎn)生［1－2］。

使用高分子材料包載蛋白藥物制成微球制劑，可達(dá)到延長藥物作用時(shí)間、提高藥效的目的。其中，聚乳酸聚乙醇酸 (PLGA)由于具有良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，成為常用的微球載體［3］。目前最常用的制備蛋白微球的方法是復(fù)乳法［4］。而改良法是在復(fù)乳法研究的基礎(chǔ)上提出的新工藝［5－7］，在微球制備的復(fù)乳和固化階段，內(nèi)水相的海藻酸鈉 (Sodium alginate，Sa)與外水相中的Ca2+相互滲透螯合成海藻酸鈣凝膠，并與微球骨架同步形成，無需二次包封，操作簡單。本實(shí)驗(yàn)以PLGA為載體，分別采用復(fù)乳法及其改良法制備IFNα－1b緩釋微球，對(duì)比了兩種方法所得微球的理化性質(zhì)、內(nèi)外形態(tài)、表面和及骨架內(nèi)的蛋白分布情況，以及體外釋放特性。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

重組人干擾素 α－1b(批號(hào):110301，IFN:1.70 g·L－1，深圳科興有限公司);海藻酸鈉 Protanal LF 200DL(美國FMC公司);聚乳酸聚乙醇酸 (PLGA，LA/GA摩爾比為50∶50，黏度為0.85 dL·g－1，美國伯明翰聚合物公司);micro BCA蛋白定量試劑盒 (美國Pierce公司);FITC－BSA(美國Sigma公司);考馬斯亮藍(lán)染色液G－250(碧云天生物研究所);二氯甲烷 (天津市富宇精細(xì)化學(xué)品有限公司);其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

FA25勻漿器 (上海弗魯克液體機(jī)械制造有限公司);L－550臺(tái)式低速大容量離心機(jī);GZ強(qiáng)力電動(dòng)攪拌器 (金壇市醫(yī)療儀器廠);ALPHA 1－4 LSC冷凍干燥機(jī) (德國 CHRIST公司);BIO－TEK ELX－800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國寶特公司);SHA－B水浴恒溫振蕩器 (江蘇省金壇市宏華制造廠);JSM26700F冷場發(fā)射掃描電鏡 (日本電子公司);EG1160石蠟切片機(jī) (德國徠卡);Leica CM1850冷凍切片機(jī) (德國徠卡);LSM710激光共聚焦顯微鏡 (德國Zeiss公司)。

2 方法

2.1 干擾素微球的制備

采用復(fù)乳法制備IFN－PLGA微球，即將適量的重組IFNα－1b粉末 (理論載藥量為1%)溶解于泊洛沙姆188(F68)溶液中，形成均一的內(nèi)水相，再與一定濃度的PLGA二氯甲烷溶液混合，在冰浴條件下高速勻漿1 min制成初乳 (W/O);將初乳迅速轉(zhuǎn)移至聚乙烯醇 (PVA)水溶液 (外水相1)中，攪拌形成W/O/W型復(fù)乳;最后將復(fù)乳轉(zhuǎn)移至大體積的PVA水溶液 (外水相2)中，低速攪拌3 h使有機(jī)溶劑揮發(fā)、微球固化。用蒸餾水洗滌3次，離心收集微球，凍干得微球粉末。

使用改良法制備微球時(shí)，在F68溶液中加入Sa粉末，使 Sa在內(nèi)水相中的質(zhì)量濃度為12 mg·L－1，外水相1、2中分別加入氯化鈣，使其對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度分別為 30 mg·L－1、5 mg·L－1，其余操作與復(fù)乳法一致。

2.2 微球包封率、載藥量和產(chǎn)率的測定

精密稱定載藥微球10 mg，并加入到5.0 mL 0.1 mol·L－1NaOH/5 mg·L－1SDS 溶液中，于 37℃水浴條件下振蕩48 h，使微球完全溶解。離心后取上清液，用BCA法測定蛋白含量。背景吸收值用空白微球裂解后的上清液作校正。

2.3 微球的表面及內(nèi)部形態(tài)

2.3.1 微球粒徑的測定量 取適量冷凍干燥后的微球，用蒸餾水分散，在光學(xué)顯微鏡下觀察微球的外觀形態(tài)，同時(shí)選擇有代表性的區(qū)域，測定300個(gè)粒子，計(jì)算平均粒徑。

2.3.2 微球形態(tài)的測定 將冷凍干燥后的微球或經(jīng)石蠟切片后的微球切片固定在導(dǎo)電膠上，置于真空條件下，噴上金粉。然后用掃描電子顯微鏡在電子束強(qiáng)度為10 kV的條件下觀察微球的表面形態(tài)。

2.3.3 微球表面及截面孔隙率 從每種處方的微球及其切片的掃描電鏡圖片中選取至少6張，使用Image J軟件分析微球及其截面的孔洞數(shù)目、孔洞總面積及微球面積，計(jì)算微球表面及截面孔隙率［8］。

2.4 蛋白在微球中的分布情況

2.4.1 微球表面的蛋白染色 分別稱取復(fù)乳法和改良法制備的IFN微球適量于離心管中，各加入適量考馬斯亮藍(lán)G－250染色液浸泡5 min，渦旋使微球粉末分散均勻。離心棄上清液后，加入適量蒸餾水洗滌微球4次，冷凍干燥后拍照。

2.4.2 蛋白在微球內(nèi)的分布情況 將兩種方法制備的載熒光蛋白FITC－BSA的微球進(jìn)行冷凍切片 (厚度約8 μm)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察微球截面中蛋白的分布情況。固定吸收波長/激發(fā)波長為488/525 nm，放大倍數(shù)為400倍。

2.5 微球的體外釋放測定

精密稱取約50 mg微球置于5 mL離心管中，加入1.5 mL PBS 液 (pH 值為7.4，含有 20 g·L－1的F68)，于37℃水浴振蕩器中以100 r/min的振速振蕩，分別于不同時(shí)間點(diǎn)定時(shí)離心過濾，取出上清液，同時(shí)補(bǔ)加新鮮的PBS。采用micro BCA微孔板法測定所取樣品中的蛋白含量，計(jì)算累積釋藥量，繪制體外釋藥曲線。分別采用零級(jí)、一級(jí)方程、Higuchi模型和 Korsmeyer－Peppas方程對(duì)釋藥行為進(jìn)行擬合。其中，Q代表累計(jì)釋放百分比，t代表時(shí)間，r代表相關(guān)系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 兩種制備方法所得微球的理化性質(zhì)研究

經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)的篩選［5－6］，得到較優(yōu)的微球制備工藝，分別以復(fù)乳法和改良法制備IFN－PLGA微球，所得微球均為流動(dòng)性良好的白色疏松粉末。其包封率分別為 54.37%，61.85%(P ＜0.05)，載藥量為0.6507%，0.7243%(P ＜0.05)，產(chǎn)率為85.27%，85.03%(P ＞0.05)，平均粒徑為 73.69 μm，71.04 μm(P ＞0.05)?？梢娛褂酶牧挤ㄖ苽涞奈⑶蚓哂休^高的包封率和載藥量，制備工藝對(duì)產(chǎn)率及平均粒徑的影響不顯著。

3.2 兩種制備方法所得微球的內(nèi)外形態(tài)

對(duì)于包載親水性大分子藥物的微球，藥物的初期釋放主要是通過孔洞擴(kuò)散，此時(shí)微球的表面孔隙率和內(nèi)部形態(tài)特征起著重要的作用［8］。使用掃描電鏡對(duì)微球表面及截面進(jìn)行觀察 (見圖1)，并運(yùn)用軟件分析微球的表面及截面參數(shù)。復(fù)乳法與改良法的表面孔隙率分別為 7.9%，0.48%(P＜0.05)，表面孔隙個(gè)數(shù)分別為221，35(P ＜0.05)，截面孔隙率分別為 48.9%，48.1%(P ＞0.05)，截面孔隙個(gè)數(shù)分別為320，146(P＜0.05)。從外觀而言，復(fù)乳法制備的微球表面孔洞較大且多，而改良法所得微球光滑圓整，表面孔洞較少且孔徑小。截面形態(tài)方面，改良法所得微球內(nèi)部孔洞較大但數(shù)目較少，截面孔隙率與復(fù)乳法相當(dāng)。

圖1 微球的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of microsphere

3.3 兩種制備方法所得微球的表面蛋白分布量

眾所周知，在體內(nèi)外釋放過程中，靠近微球表面的藥物最先擴(kuò)散出來，其中淺表蛋白分布量較多的微球，容易產(chǎn)生突釋［9］，有可能導(dǎo)致血藥濃度接近或超過中毒水平，產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。考馬斯亮藍(lán)G－250染色液可以專屬性地對(duì)蛋白染色，游離的G－250與蛋白結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。從染色微球的表面顏色深淺可得知淺表的蛋白分布量［10］，預(yù)測微球的突釋效應(yīng)。分別對(duì)兩種方法制得的IFN微球進(jìn)行染色，從圖2可得改良法所得微球的外觀以淺藍(lán)色為主，帶有少量深藍(lán)色微粒;而復(fù)乳法組微球則均一地呈現(xiàn)深藍(lán)色。說明改良法所得微球的表面蛋白分布量較少。

3.4 蛋白在微球內(nèi)部的分布情況

使用激光共聚焦顯微鏡可觀察到樣品中的熒光物質(zhì)，從而直觀地得到藥物在制劑中的分布情況［11－12］。以熒光蛋白 FITC－BSA(激發(fā)波長:495 nm;綠色熒光)代替IFN作為模型蛋白制備微球，通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)載藥微球的切片進(jìn)行掃描，觀察熒光蛋白在不同制備工藝所得微球中的分布情況 (圖3)。圖中發(fā)亮物質(zhì)為FITC－BSA，亮度越高的地方代表蛋白量越多。可見改良法所得微球的內(nèi)部分布著大小不均一的孔洞，孔洞之間相對(duì)獨(dú)立，蛋白較多地分布在微球中部和內(nèi)部;而復(fù)乳法所得微球內(nèi)部孔洞多，且孔隙連通性高，蛋白幾乎均勻分布于微球孔壁上。

圖3 FITC－BSA微球切片的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.3 Laser scanning confocal microscopy pictures of FITC－BSA microspheres slices

3.5 兩種制備方法所得微球的體外釋放性能的研究

考察兩種制備方法所得微球的體外釋藥行為，分別測定不同時(shí)間的釋藥量，以橫坐標(biāo)為釋藥時(shí)間，縱坐標(biāo)為累計(jì)釋藥百分比繪制曲線 (圖4)，并對(duì)體外釋放曲線進(jìn)行擬合。結(jié)果可得，復(fù)乳法1 d的突釋百分比 (37%)大于改良法 (30%)。前者7 d內(nèi)累積釋放達(dá)到72%，但此后階段的釋藥量少，30 d僅釋放79%。而改良法所得微球在2～20 d的范圍內(nèi)以均勻速度釋放藥物，緩釋時(shí)間較長，30 d的累積釋放接近70%。兩法所得微球的釋藥曲線均符合 Korsmeyer－Peppas方程 (r＞0.97)，分別為 Q=40.397 t0.230，Q=30.147 t0.256。方程指數(shù)均小于0.43，提示藥物主要以擴(kuò)散形式釋放。

圖4 微球的體外釋放圖Fig.4 Effect of microsphere preparation method on the drug release

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在同等條件下對(duì)比了改良法與復(fù)乳法制備的IFN－PLGA微球的載藥特性，包括微球的理化性質(zhì)、內(nèi)外形態(tài)、微球表面及骨架內(nèi)的蛋白分布情況，以及體外釋放行為。

改良法是在復(fù)乳法的工藝基礎(chǔ)上，于內(nèi)水相添加了Sa，外水相添加了氯化鈣。該法制備的微球具有較高的包封率和載藥量，其表面的蛋白量少、孔洞較少且孔徑小。主要原因是由于在微球制備的復(fù)乳及固化過程中內(nèi)外水相相互滲透:外水相中的Ca2+與分散于油相中含Sa的內(nèi)水相液滴相互螯合，或者Sa液滴往外水相擴(kuò)散過程中與Ca2+螯合形成海藻酸鈣凝膠，一定程度地填充因溶劑揮發(fā)在微球內(nèi)形成的孔隙，使微球表面更為緊密。此外，海藻酸鈣凝膠的形成，可減緩內(nèi)水相液滴中的蛋白藥物往外水相擴(kuò)散，減少微球表面的藥物分布量，使更多的蛋白包封于微球中。

從微球截面的掃描電鏡圖可得，改良法所得微球內(nèi)部孔洞較大而數(shù)目較少，孔徑分布不均，總體的截面孔隙率與復(fù)乳法相當(dāng)。這是由于Sa的添加大大增加了內(nèi)水相的黏度［13］，從而使微球制備過程中內(nèi)水相液滴大小均勻性下降、液滴更容易破裂融合成更大的液滴，致使干燥后的微球內(nèi)部呈現(xiàn)大小不一的孔洞，孔洞數(shù)目顯著少于復(fù)乳法制備的微球。

與復(fù)乳法相比，改良法可增加微球表面結(jié)構(gòu)致密性，降低淺表蛋白分布量，使微球突釋率顯著降低，緩釋天數(shù)由7 d提高到20 d以上。釋放過程中溶出介質(zhì)逐漸滲入微球內(nèi)部，分布于骨架中的海藻酸鈣凝膠慢慢吸水膨脹，一定程度地減慢藥物擴(kuò)散，延長藥物釋放時(shí)間，提高后期藥物釋放濃度;但30 d內(nèi)累積釋藥率稍低于復(fù)乳法。除了微球結(jié)構(gòu)緊密、海藻酸鈣延緩釋藥的原因外，可能存在小部分藥物與凝膠或載體結(jié)合緊密，以至釋放緩慢。

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