大鼠原位腎移植模型的建立及技術(shù)改進(jìn)

林淼，王繼納，許明，戎瑞明，朱同玉，(.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 0003；.上海市器官移植重點(diǎn)實驗室，上海 0003)

腎移植是目前尿毒癥患者的首選治療手段。由于臨床試驗的諸多限制性，因而建立合適的腎移植動物模型對腎移植相關(guān)基礎(chǔ)及應(yīng)用研究具有重要的應(yīng)用價值。大鼠原位腎移植模型是目前國內(nèi)外進(jìn)行腎移植相關(guān)免疫學(xué)研究普遍采用的動物模型[1]。為了建立更加穩(wěn)定、簡便易操作的大鼠腎移植模型，在過去的40多年中，各種技術(shù)改進(jìn)不斷地被應(yīng)用于大鼠腎移植模型的建立中[2-3]。通過不斷摸索及技術(shù)改進(jìn)，本中心采用動脈端端吻合、靜脈端端吻合和輸尿管端端吻合法建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠腎移植模型，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材 料

1.1 實驗動物

無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠，體重250～300 g，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗動物中心購置并飼養(yǎng)。動物合格證號：SYXK(滬)2013-0039。

1.2 實驗器械

顯微外科器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠，SB0220)，臺式手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)光儀器有限公司，SXP-1C)，常規(guī)手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)，沖洗針頭、血管夾，自制腹腔拉鉤，6-0、8-0及11-0帶針顯微縫線，3-0帶針縫合線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)，動物實驗用雙極止血電刀(Gemini Cautery System，Stoelting Co.美國)。

1.3 實驗藥品

1%戊巴比妥鈉(德國進(jìn)口，批號20090512)，肝素鈉(上海福達(dá)制藥有限公司，批號101004)，2%利多卡因(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號101103)，乳酸鈉林格液(上海長征富民金山制藥有限公司)，碘伏(上海利康消毒高科技有限公司)，生理鹽水(浙江天瑞藥業(yè)有限公司)，青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)。

2 模型的建立方法

2.1 麻醉

供受鼠均為Wistar大鼠，術(shù)前12小時禁食，不禁水，1%戊巴比妥鈉10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。

2.2 供腎切取

大鼠麻醉后，備皮消毒，仰臥位取腹正中切口，沿腹中線從劍突下至恥骨聯(lián)合上剪開皮膚及肌肉進(jìn)入腹腔，勿傷及腸道。自制腹腔拉鉤牽開腹腔，濕棉簽向右側(cè)推開腸道，顯微剪游離脾結(jié)腸韌帶，將左側(cè)腸道推至右側(cè)腹腔切口外，以生理鹽水濕紗布包裹。

打開后腹膜，滴注2%的利多卡因約1 ml于血管，保持血管濕潤的同時還可以減輕血管游離過程中的痙攣現(xiàn)象。濕棉簽推開腹主動脈與下腔靜脈表面脂肪組織，自腹主動脈分叉處向上充分游離腹主動脈及下腔靜脈至左腎動脈以上水平。顯微鑷游離輸尿管，注意保留伴行血管，游離至腎下極2 cm處斜行剪斷輸尿管。游離腎臟至近腎門處，保留少量腎周脂肪組織以便牽拉腎臟。自近端向遠(yuǎn)端游離腎動脈及腎靜脈至近腎門，8-0顯微縫線結(jié)扎腎靜脈分支，如性腺血管、腎上腺動靜脈。處理腎動靜脈時，仔細(xì)操作，注意變異小分支的存在，并同樣分離結(jié)扎或電刀電灼止血。

腎動脈、腎靜脈、下腔靜脈及腹主動脈游離充分后，取1 ml肝素生理鹽水(100 U/ml)于陰莖背靜脈注射，全身肝素化受鼠。于左腎動脈與右腎動脈間腹主動脈下方穿過6-0絲線一根，打好空的外科結(jié)、暫不收緊。腹主動脈分叉處上方以同樣的方法置空結(jié)線一根，并以血管夾于此線下方阻斷腹主動脈，收緊最上方的外科結(jié)，緊貼下腔靜脈剪斷左腎靜脈。于血管夾阻斷水平以上的腹主動脈以28G留置針穿刺，收緊預(yù)置的6-0空結(jié)線，固定針頭。緩慢勻速注入4℃肝素生理鹽水，可見腎靜脈端口流出血性液體，持續(xù)注入灌注液至靜脈端流出液為無色，腎臟顏色蒼白為止，總量約5 ml。近腹主動脈離斷腎動脈，取下腎臟，放入已預(yù)置冰上的肝素生理鹽水中。

2.3 供腎移植

同供鼠操作，暴露受鼠游離腎臟，結(jié)扎腎上腺、性腺血管等分支，游離左腎動脈、腎靜脈，于腎門下約1 cm處結(jié)扎并斜行剪斷輸尿管。近腹主動脈及下腔靜脈，以動脈夾阻斷腎動脈、腎靜脈，近腎門剪斷腎動、靜脈，移除受體左腎。用肝素生理鹽水沖洗近端殘端，盡量沖出殘留血液，修剪斷面。

用紗布自制帶洞腎袋，置入供腎，使腎動脈、靜脈和輸尿管經(jīng)洞口暴露于腎袋外，腎袋表面撒少量冰水，以保持腎臟低溫。首先吻合位于背面的腎動脈，采用11-0帶針縫線兩定點(diǎn)法行間斷吻合。首先于腎動脈上方和下方縫合兩針，分別用血管夾固定作牽引。先縫合前壁，在前壁正中縫合一針，暫不打結(jié)。在中點(diǎn)針與上、下定點(diǎn)的中點(diǎn)處各縫合一針，均暫不打結(jié)，待3針均結(jié)束以后依次打結(jié)。翻轉(zhuǎn)固定線，使后壁朝前，同法縫合后壁，完成后剪斷固定線，動脈共計吻合8針(含兩定點(diǎn))。腎靜脈也采用兩定點(diǎn)法，11-0帶針縫線連續(xù)縫合。先縫合后壁，縫完后壁后與相連固定線打結(jié)，無需翻轉(zhuǎn)固定線，繼續(xù)縫合前壁。前后壁各縫合7針左右，縫合完成后剪斷固定線。

經(jīng)陰莖背靜脈注入含80 kU青霉素鈉的溫生理鹽水約3 ml補(bǔ)充血容量，使用血管夾分別阻斷吻合口遠(yuǎn)端的腎動脈及腎靜脈，開放吻合口近端血管夾，觀察血管通暢與否，是否有明顯滲漏。一般而言，開放血管后初期可見吻合口少量滲血，采用棉簽輕輕壓迫1分鐘后即可止血。如出血明顯難以止住，則可謹(jǐn)慎進(jìn)行補(bǔ)縫。血管吻合通暢后剪開腎袋，開放腎門處血管夾，觀察腎臟灌注后顏色與質(zhì)地，輸尿管口有無尿液流出。如吻合口通暢，30秒內(nèi)可見腎臟迅速變紅，質(zhì)地變硬，動脈搏動良好，靜脈充盈。

繼續(xù)觀察輸尿管口5分鐘左右，見尿液流出后行輸尿管端端吻合。采用11-0帶針縫合線，斜行貼合兩輸尿管殘端，分別于4點(diǎn)間斷縫合輸尿管。最后切除右側(cè)腎臟，檢查腹腔有無活動性出血，溫生理鹽水沖洗腹腔，以利于受鼠復(fù)溫。使用3-0帶針縫合線縫合肌肉、皮膚，手術(shù)結(jié)束。

2.4 術(shù)后處理

麻醉蘇醒前將大鼠置于實驗動物用保溫毯上復(fù)溫，麻醉復(fù)蘇后即可恢復(fù)飲食，注意保持干燥、保暖，每只受鼠單獨(dú)置一籠，繼續(xù)飼養(yǎng)于本院SPF級實驗動物中心。

3 結(jié) 果

對已完成的10對大鼠移植時間進(jìn)行統(tǒng)計，完成1對大鼠腎移植需要(211.00±13.24)分鐘，其中供腎切取手術(shù)時間為(87.00±5.34)分鐘，供腎移植手術(shù)時間為(120.00±7.90)分鐘；供腎移植中原腎臟切除(27.00±1.12)分鐘，動脈吻合(35.00±1.98)分鐘，靜脈吻合(36.00±3.26)分鐘，輸尿管吻合(22.00±1.54)分鐘。供腎熱缺血時間為30秒，腎臟冷缺血時間約為100分鐘。

一般認(rèn)為，大鼠失去雙側(cè)腎臟24小時內(nèi)將死亡，因此，我們選擇術(shù)后3天為界限，判斷腎移植是否成功。在實驗技術(shù)成熟后，我們進(jìn)行了10對大鼠原位腎移植，其中8對大鼠存活時間大于3天，移植腎均稍增大，形態(tài)、功能良好，其余2對大鼠死亡原因包括吻合口出血、血栓形成、尿漏等。

縫合完成后，可見動脈搏動良好，吻合口通暢，腎靜脈飽滿，回流通暢(圖1)，動脈位于背面不可見。吻合口附近稍有滲血，已止住。解剖術(shù)后3天仍存活的大鼠，可見移植腎形態(tài)良好(圖2)，體積稍有增大，大體形態(tài)未見異常。

圖1 大鼠左側(cè)腎臟移植模型，血管開放后

圖2 左側(cè)腎臟移植術(shù)后3天大鼠移植區(qū)探查

4 討 論

目前在國際上，大鼠腎移植模型的建立方法已經(jīng)比較多樣化，其中包括腎動脈及腎靜脈的端端和端側(cè)吻合，輸尿管的端端和帶膀胱瓣吻合，以及類似于肝移植的支架吻合法等[4-5]。但這些方法均不符合腎臟原有解剖位置，且各有不足之處：如血管端側(cè)吻合易出現(xiàn)術(shù)后出血等并發(fā)癥，且灌注壓相對不足，術(shù)中阻斷腹主動脈及下腔靜脈容易導(dǎo)致其他器官的缺血性損傷及血栓形成；套管法僅適用于靜脈，需自制套管，且由于不同大鼠血管條件不同，利用多有限制；輸尿管帶膀胱瓣吻合對受鼠損傷較大，由于供腎輸尿管游離路徑較長，易導(dǎo)致輸尿管血管損傷，進(jìn)而引起術(shù)后缺血性壞死。故本文采用了腎血管及輸尿管端端吻合，這是最符合腎臟生理解剖的方法[6-7]。

手術(shù)操作首先涉及視野的暴露，作者采用了大回形針自制拉鉤，前方為三角形拉鉤，后方為折彎銳頭。此種拉鉤可自行控制拉鉤大小、角度和長度，用于手術(shù)視野暴露十分方便。采用左、右和上方三個拉鉤暴露，可較好顯露操作視野。

如何安全充分地游離腹主動脈、下腔靜脈及腎動脈、腎靜脈，是手術(shù)成功重要環(huán)節(jié)。大鼠靜脈壁較薄，游離時易撕裂出血。為此作者采用了彎頭眼科鑷，探入背側(cè)后從動靜脈之間進(jìn)行分離，同時可使用顯微鑷從腹側(cè)協(xié)助操作。該游離方法特別適用于腹主動脈與下腔靜脈間的分離，十分簡單易行、安全可靠。

術(shù)中止血是本手術(shù)成功的另一重要環(huán)節(jié)。大鼠血管較細(xì)，除腹主動脈、下腔靜脈、腎動靜脈等大血管以外，大部分血管的出血均通過壓迫即可止住。出血位置明確處可用電刀電灼止血，或者用棉簽壓迫止血；如出血位置較隱蔽或較深，難以觸及，可使用顯微鑷鉗夾，以電刀電灼顯微鑷尖端止血。

充分的供腎灌注是保持移植腎功能的必要條件。行腎臟灌注前，首先要做好血管準(zhǔn)備。分離腎動靜脈根部粘連處，彎頭眼科鑷從動靜脈上方插入，往下方分離，可安全便捷地從根部開始分離腎動靜脈。分離完成后，于相應(yīng)位置的腹主動脈下方穿過6-0絲線一根，打好空的外科結(jié)、暫不收緊，相較于利用血管夾阻斷可減少熱缺血時間。沖洗過程應(yīng)保持流速的穩(wěn)定、均一，一般沖入5 ml液體即可，具體沖洗量以沖洗至流出液清澈為止。

腎動靜脈吻合完成后，在開放前需要經(jīng)陰莖背靜脈注入含80 kU青霉素鈉的溫生理鹽水約3 ml。補(bǔ)液一方面是為了補(bǔ)充手術(shù)中丟失的體液，如出血、非顯性蒸發(fā)等；另一方面是為了預(yù)防術(shù)后感染，青霉素鈉屬于易于得到而且效果良好的抗菌藥物[2]。

輸尿管縫合一直是大鼠腎移植的一個難點(diǎn)。作者采用了輸尿管端端4針吻合法。在外科顯微鏡下看見兩斷端輸尿管開口后，使用帶線雙頭針，分別由管腔內(nèi)向管腔外縫合，出針后先不打結(jié)，待4針均完成后一次性打結(jié)，以避免打結(jié)后導(dǎo)致輸尿管口不可見，影響后續(xù)縫合。

另外，相比于SD大鼠，Wistar大鼠腎動靜脈上方動靜脈分支極多，且常有變異，在脂肪組織覆蓋下，無論是鈍性分離還是銳性分離均極易出血。這些血管多為腎動靜脈發(fā)出，出血后極難止血。因此，為了安全便捷地結(jié)扎包括腎上腺動靜脈在內(nèi)的這些分支血管，作者先從腎臟上極處開始游離脂肪組織至后腹膜，在視野內(nèi)小心分離至腎動靜脈上方，而后在腎上腺動靜脈根部兩側(cè)亦小心分離脂肪組織至后腹膜。到目前為止，腎動靜脈上方總共有兩堆包含血管的脂肪組織，采用8-0線分別牢固結(jié)扎后剪斷。采用該法處理腎血管上方分支十分安全，且操作簡單，可大幅縮短分離時間。

采用改進(jìn)后的上述操作方法，短期練習(xí)后即可安全、便捷地建立成熟、穩(wěn)定的大鼠原位腎移植模型。從前期的實驗結(jié)果可見，本方法所建立的腎移植模型中受鼠存活率較高，術(shù)后手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥較少，移植腎功能良好。