響應(yīng)面法優(yōu)化多刺綠絨蒿中總黃酮的提取工藝＊

羅云演， 張秋龍， 丁晨旭

（1.青海民族大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810007；3.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海 西寧810001；4中國(guó)科學(xué)院 研究生院，北京100049）

多刺綠絨蒿（MeconopsishorridulaHook.f.＆ Thomson）為一年生罌粟科綠絨蒿屬草本植物，高約15～20cm，全株包被黃褐色或淡黃色堅(jiān)硬而平展的刺，主要分布于中國(guó)青海、西藏、云南和甘肅，緬甸、印度東北部、不丹、錫金和尼泊爾也有分布，生長(zhǎng)于海拔3 000～5 000米的山坡石縫中.多刺綠絨蒿味苦，有活血化瘀、止痛功效，主要用于治療頭傷、跌打損傷等癥［1－3］.通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5－11］，綠絨蒿屬植物含有大量的黃酮類化合物，多刺綠絨蒿的化學(xué)成分主要為黃酮、生物堿和揮發(fā)油，其中以黃酮類化合物居多，而近年來(lái)的研究表明，黃酮類化合物具有廣泛的生物學(xué)活性［12－14］.

為了充分開發(fā)利用藏藥多刺綠絨蒿，本文運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)多刺綠絨蒿總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；AL204電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司.

多刺綠絨蒿，采自青海省海北門源地區(qū)，由當(dāng)?shù)夭蒯t(yī)鑒定；蘆丁對(duì)照品：上海順勃生物工程有限公司（含量大于98%），批號(hào)：201203；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和乙醇均為分析純.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.2.1 蘆丁貯備液配制

精密稱取蘆丁對(duì)照品8.75mg，用30%乙醇溶解于25mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.35mg／mL貯備液.

1.2.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］

分別吸取貯備液0.0mL、0.5mL、1mL、1.5 mL、2mL、2.5mL，置于6個(gè)25mL容量瓶中，再分別用30%乙醇約定容至10mL，搖勻，隨后加入5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻，靜置4min，加入 10%Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，靜置10 min，加入1mol／L NaOH 溶液5mL，搖勻，最后30%乙醇定容至刻度，充分混勻，放置15min，得相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液.500nm處測(cè)吸光度值，以該系列中1號(hào)對(duì)照品液（0mg／mL）為參比，蘆丁濃度C（mg／mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝20.614x＋0.000 1，R2＝0.999 2.

1.3 多刺綠絨蒿中總黃酮的提取

稱取多刺綠絨蒿藥材粉末（過(guò)40目篩）1g，加入60%乙醇25mL，超聲5min，后于70℃熱回流70min，提取2次，合并濾液.濃縮濾液，并用30%乙醇10mL溶解，精密量取0.5mL于25mL容量瓶中，按“1.2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)量吸光度.

1.4 多刺綠絨蒿中總黃酮的提取工藝設(shè)計(jì)

選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）等影響總黃酮提取率較大的因素，并根據(jù)影響多刺綠絨蒿中總黃酮提取因素考察試驗(yàn)的結(jié)果選擇相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)水平.采用Design expert.V.8.0.6軟件中Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平方案，以多刺綠絨蒿總黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)軟件分析得出提取多刺綠絨蒿中總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 中心組合設(shè)計(jì)表Table 1 The central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 影響多刺綠絨蒿中總黃酮提取因素考察試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度考察試驗(yàn)

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項(xiàng)下方法，于70℃，料液比1∶25的條件下，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70% 和 80%，熱回流提取70min，考察試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1 乙醇溶液濃度考察試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The test results of ethanol concentration

由圖1可知，在乙醇濃度小于60%時(shí)，提取率隨著乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，提取率反而隨之下降，且葉綠素等物質(zhì)的溶出增加，不利于測(cè)定，故選擇乙醇濃度為60%左右.

2.1.2 液料比考察試驗(yàn)

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項(xiàng)下方法，于70℃，乙醇濃度60%條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1，熱回流提取70 min，考察試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 液料比考察試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The test results of ratio of liquid to solid

由圖2可以看出，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1左右時(shí)，隨著提取劑用量增加，提取率變化不大，而25∶1之后，可能是雜質(zhì)的溶出增加，影響了總黃酮的溶出，提取率故略有所下降，所以選擇液料比為25∶1左右.

2.1.3 提取時(shí)間考察試驗(yàn)

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項(xiàng)下方法，于70℃，乙醇濃度60%，液料比25∶1條件下，分別熱回流提取50min、60min、70min、80min和90min，考察試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 提取時(shí)間考察試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The test results of extracting time

由圖3可知，提取時(shí)間在由50min逐漸上升至70min時(shí)，總黃酮提取率顯著增加，而70min后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)提取率有所下降，可能是多刺綠絨蒿中黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)熱具有一定的不穩(wěn)定性，故選擇提取時(shí)間為70min左右.

2.1.4 提取溫度考察試驗(yàn)

圖4 提取溫度考察試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The test results of temperature

稱取藥材粉末1g，按“1.3”項(xiàng)下方法，于乙醇濃度60%，液料比25∶1條件下，分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中浸提70min，考察試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

由圖4可見(jiàn)，70℃以后，隨著提取溫度的升高，提取率有所下降，可能是多刺綠絨蒿中黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞所致，另一方面雜質(zhì)的溶出量增加，影響測(cè)定，所以選擇提取溫度為70℃左右.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與相關(guān)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

本文采用 DesignExpert.V.8.0.6軟件，對(duì)表2中響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出回歸方程方差分析表及相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experiment designs and results of RSM

響應(yīng)面軟件程序?qū)Ρ?中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，得到的回歸方程：多刺綠絨蒿總黃酮的提取率＝1.41＋0.10＊A＋0.058＊B－0.091＊C－0.043＊A＊B＋0.023＊A＊C－0.020＊B＊C－0.061＊A2＋0.022＊B2－0.079＊C2

表3 回歸方程方差分析表Table 3 ANOVA for quadratic polynomial model

由表3可知，三個(gè)因素對(duì)提取率影響優(yōu)先順序?yàn)椋阂掖紳舛龋疽毫媳龋咎崛r(shí)間，回歸模型P值小于0.000 1達(dá)到極顯著水平，方程相關(guān)系數(shù)R2＝0.925 9，說(shuō)明該模型擬合度較好，失擬項(xiàng)P＝0.947 4（P＞0.1）不顯著，表明本實(shí)驗(yàn)所得二次回歸方程高度顯著，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠.兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖如圖5－7.

圖5 乙醇濃度與液料比交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between concentration of ethanol and ratio of liquid to solid

圖6 乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between concentration of ethanol and extracting time

圖7 液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface curve for extraction yield of total flavonoids showing interaction between ratio of liquid to solid and extracting time

3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證根據(jù)模型優(yōu)化條件得到的最佳理論工藝條件（乙醇濃度64.36%、液料比29.88∶1，提取時(shí)間66.01min時(shí)，總黃酮提取率理論值為1.530%）的可靠性，實(shí)際操作中將工藝修正為乙醇濃度64%、液料比30∶1和提取時(shí)間66min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率為1.521%（n＝3，RSD＝0.399%）與預(yù)測(cè)值相差不大.

4 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇熱回流提取多刺綠絨蒿中總黃酮，得出最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度64%，液料比30∶1，提取時(shí)間66min，經(jīng)檢驗(yàn)，在此工藝條件下，總黃酮提取率為1.521%（n＝3），與預(yù)測(cè)值相差不大，表明該模型是合理可靠的，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

［1］孫紅祥，奚鏡清.多刺綠絨蒿的考釋［J］.中國(guó)中藥雜志，1993，18（8）：454.

［2］劉松渝.綠絨篙屬植物的生物堿［J］.華西藥學(xué)雜志，1987（3）：173－175.

［3］王彬，宋學(xué)華，蹼社班.藏藥“歐貝”和“刺兒恩”的性狀鑒定研究［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2003，11（3）：23－25.

［4］張秋龍，梁永欣，李文聰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)果角茴香中總黃酮的超聲提取條件［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25：841－845.

［5］馬明芳，丁克毅，丁立生，等.多刺綠絨蒿的化學(xué)成分研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24（3）：227－229.

［6］吳海妹，袁瑞瑛，小尼瑪頓珠，等.多刺綠絨蒿的化學(xué)成分［J］.藥學(xué)與臨床研究，2012，20（4）：314－316.

［7］袁瑞瑛，旦歐，次登，等.藏藥多刺綠絨蒿化學(xué)成分研究現(xiàn)狀［J］.西藏科技，2012，230（5）：64－66.

［8］李啟發(fā).通關(guān)藤和多刺綠絨蒿的化學(xué)成分研究.西南民族大學(xué)碩士學(xué)位論文［D］.成都：西南民族大學(xué)，2007.

［9］吳海峰，潘莉，鄒多生，等.3種綠絨蒿揮發(fā)油化學(xué)成分的GC－MS分析［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（17）：1298－1300.

［10］吳海峰.五種綠絨蒿藏藥材化學(xué)成分研究［D］.西寧：中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，2009.

［11］馬應(yīng)龍.多刺綠絨蒿化學(xué)成分的研究［D］.西寧：青海師范大學(xué)，2008.

［12］云南蜂膠和山東蜂膠醇提物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，33（2）：70－73.

［13］呂海英，林雨，潘云，等.黑果枸杞葉總黃酮抗氧化和降血脂成分測(cè)定［J］.新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，31（2）：43－48.

［14］孟慶華，于曉霞，張海鳳，等.天然黃酮類化合物清除自由基機(jī)理及其應(yīng)用進(jìn)展［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，21（2）：79－83.