WspR在大腸桿菌中的表達(dá)及其對(duì)c－di－GMP合成的影響＊

凡責(zé)艷， 木佳， 毛自朝， 官會(huì)林

（1.云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650092；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201）

可得膠（curdlan），又稱熱凝膠，是農(nóng)桿菌ATCC31749菌株所產(chǎn)生的一種胞外多糖，由400～500個(gè)D－葡萄糖以β－（1→3）糖苷鍵線性連接而成的一類葡聚糖［1－2］；由于其具有凝膠強(qiáng)度高、熱成型后不可逆、無色、無味和保水力強(qiáng)等特性，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、建筑及化工行業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域，在食品、化妝品等中用為添加劑；其抗HIV、抗腫瘤、提高免疫力活性等特性使其具有廣闊的醫(yī)用前景［3－4］.目前全球可得膠產(chǎn)品約有60億美元的市場(chǎng)份額，并預(yù)計(jì)以每年10%左右的需求速度增長.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)菌胞外多糖的合成受控于新近發(fā)現(xiàn)環(huán)二鳥苷酸（c－di－GMP），該c－di－GMP是細(xì)菌中參與各種生理功能調(diào)節(jié)的第二信使［5－7］，其合成及分解涉及三個(gè)蛋白質(zhì)域，其中GGDEF結(jié)構(gòu)域?yàn)閏－di－GMP合成中的二鳥核苷酸環(huán)化酶，而 EAL 和 HD－GYP域是c－di－GMP分解中的磷酸二酯酶［5，8－9］.細(xì)菌中廣泛分布有 這三個(gè)結(jié)構(gòu)域［5－6，9］，具有GGDEF、EAL、及HDGYP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與到細(xì)菌纖維素生物合成、移動(dòng)性、附著性、生物膜形成、毒力因子生產(chǎn)和致病 性［7－8，10－12］.作為細(xì)菌中的第二信使，c－di－GMP除具有上述功能外，還能夠刺激胞外多糖的生物合成［13］.大量研究表明，從綠膿桿菌（P.aeruginosa）中得到的類超化系統(tǒng)蛋白WspR具有GGDFE結(jié)構(gòu)域，有DGC活性，可促進(jìn)c－di－GMP的合成［14－17］.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，土壤農(nóng)桿菌ATCC31749含有十幾個(gè)GGDEF保守結(jié)構(gòu)域［18］.因此，如能在 ATCC31749中提高 WspR的表達(dá)活性，就能提高c－di－GMP的產(chǎn)生，從而促進(jìn)胞外多糖可得膠的合成.本實(shí)驗(yàn)將ATCC31749的WspR克隆到pQE81L，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，以確定WspR的表達(dá)是否可促進(jìn)c－di－GMP的合成，下一步探究WspR在ATCC31749中作用及其對(duì)可得膠的合成調(diào)控研究提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒

土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749、WspR cDNA模板，大腸桿菌BL21（DE3），質(zhì)粒載體pQE81L，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶（SalI，BamHI）和 T4DNA連接酶購自Promega公司；Tap DNA聚合酶和dNTP購自TakaRa公司；血紅素、吖啶黃、ABTS（2，2－聯(lián)氮－二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸）二銨鹽）、30%過氧化氫購買于sigma公司，其他試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中報(bào)道的pQE81L－WspR基因序列，設(shè)計(jì)合成含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的上下游引物，并由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)pQE81L－WspR基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′－GCGGATAACAATTTCACAC－3′；下游引物：5′－GCAGCACCAGGTTAGTTTCC－3′.PCR反應(yīng)體系為：WspR 的cDNA 模板2.5 μL，10×PCR buffer 5 μL（含 Mg2＋），2.5 mmol／L的dNTP 4μL，50μmol／L的上下游引物各1μL，5U／μL的Tap DNA聚合酶0.5μL，加去離子水至總體積為50μL.PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min.結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃冰箱，留待電泳檢測(cè).PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：配制1%（w／v）的瓊脂糖凝膠，取5μL的PCR產(chǎn)物pQE81L－WspR同1μL的6×Loading buffer（1mL 6×Loading buffer混有25μL的花青素）混勻上樣，所用Marker為250bp－I DNA ladder.上樣后，凝膠于1×TAE緩沖液中，120V，電泳45min.電泳結(jié)束后使用IQuant capture凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析.

1.2.3 WspR蛋白表達(dá)的初步檢測(cè)

1.2.3.1 WspR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將凍存的含有pQE81L－WspR的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株中，在LB含卡那霉素抗性固體平板上劃線活化，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12～16h.挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床中200rpm振蕩過夜培養(yǎng).次日，按1∶100的比例，將種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，200 rpm，37 ℃振蕩培養(yǎng).待OD600達(dá)到0.5～1.0時(shí)，加入0.1mol／L的IPTG至終濃度為1mmol／L，之后低溫30℃，200rpm振蕩培養(yǎng).并在培養(yǎng)0，2，4，6h后分別取樣1mL，留作SDS－PAGE電泳檢測(cè).

1.2.3.2 WspR誘導(dǎo)表達(dá)后粗蛋白樣品的處理

將誘導(dǎo)時(shí)所取的樣品12 000rpm離心5min，棄去上清液.用無菌去離子水清洗細(xì)胞沉淀，同樣12 000rpm離心，棄上清，并重復(fù)1次.按照0.2g／mL的比例加2×Loading Buffer（其中含5%的巰基乙醇），混勻.混勻后的樣品于沸水中煮15min，之后液氮速凍，如此重復(fù)3次.解凍后，12 000rpm 離心3min.留待SDS－PAGE檢測(cè).

1.2.4 c－di－GMP的粗提取

將菌株BL21pQE81L－WspR、BL21 pQE81L分別用接種環(huán)蘸取一定量在已倒好的LB固體培養(yǎng)基上劃板培養(yǎng)，37 ℃恒溫?fù)u床中180rpm培養(yǎng)12h，然后分別在兩菌株平板上挑取一個(gè)單菌落接于5mL LB液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)菌株BL21pQE81L－WspR的培養(yǎng)基加入Amp抗生素，培養(yǎng)菌株BL21pQE81L的培養(yǎng)基加入Amp和Kan抗生素），37℃恒溫?fù)u床中180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取1mL上述菌液接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床中180rpm振蕩培養(yǎng)4～6h，至 OD600值為0.4～0.6左右，停止培養(yǎng)；在超菌臺(tái)上往培養(yǎng)基中加入0.1M的IPTG 250μL（最終濃度為0.5M）誘導(dǎo)，28℃搖床，180 rpm培養(yǎng)4h.

把上述誘導(dǎo)好的菌液分別用兩個(gè)50mL的離心管平均分裝成兩管（每管25mL），高速離心機(jī)4℃，12 000rpm離心15分鐘；倒掉上清液，沉淀用25mL的雙蒸水洗滌一次，4 ℃，12 000 rpm離心10分鐘后，再重復(fù)一次；倒掉上清液，用1mL 10mM Tris－HCl （pH 8.0，含100mM NaCl）溶液進(jìn)行重懸；向懸浮液中加入25μL的25mg／mL的溶菌酶；將懸浮液用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞（2mm超聲探頭，50%功率）每次3s，間隙3s，30min，使外膜破裂，溶菌酶進(jìn)入細(xì)胞壁；向溶液中加入60%的HClO4，至終濃度為20%，使懸浮液的大分子物質(zhì)沉淀；將懸浮液放置于冰上10min，用約1.5mL 3MKOH（含0.4M Tris和2MKCl）溶液中和至PH＝7.0；再次用高速離心機(jī)12 000r／min，4℃離心10min；取上清液，用0.2μm濾膜的細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾，即得到c－di－GMP粗提取品，將濾液用2mL的離心管保存在－80℃冰箱備用.

1.2.5 c－di－GMP的初步檢測(cè)

本過程分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組加入菌株BL21pQE81Lc－di－GMP的粗提取物，實(shí)驗(yàn)組加菌 株 BL21pQE81L－WspR 的 c－di－GMP 粗提物.

取四個(gè)無菌2.5mL的離心管，其中兩管里加入23ul的pQE81L，另外兩管兩管里加入23 μL的pQE81L－WspR，然后往四個(gè)離心管里各加入50mM Tris－HCl（pH 8.0，含100mM KCl）550μL，血紅素32.6μL混勻，放入水浴鍋中加熱至95℃，并保持5min；冷卻上述混合液至常溫，保持15min，分別往四個(gè)離心管里加入2.6 μL的吖啶黃，放入4 ℃冰箱12h；從冰箱里取出，分別往里面加入109.8μL ABTS，并放入16℃冰箱15min；然后加入5μL的30%的過氧化氫混勻，觀察各管內(nèi)顏色變化，即可檢測(cè)出c－di－GMP合成酶基因WspR在大腸桿菌中的表達(dá)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pQE81L－WspR的構(gòu)建

將質(zhì)粒載體pQE81L和目的基因片段WspR進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）得到重組質(zhì)粒，如圖1所示.

圖1 pQE81L－WspR質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.1 The process of building plasmid pQE81L－WspR

2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)攜帶pQE81L－WspR的陽性轉(zhuǎn)化子

轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的質(zhì)粒pQE81L－WspR，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)呈陽性的克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜中呈現(xiàn)588bp左右的目的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明大腸桿菌BL21PQE81L已攜帶WspR的陽性轉(zhuǎn)化子，如圖2所示.

圖2 pQE81L－WspR的鑒定Fig.2 The identification of pQE81L－WspR

2.3 蛋白表達(dá)結(jié)果

通過SDS－PAGE凝膠電泳，可以初步確定蛋白表達(dá)圖譜上增加了一條40kD左右的條帶，為WspR蛋白，如圖3所示.

圖3 pQE81L－WspR在E.coli BL21菌株中的表達(dá)Fig.3 The expression of pQE81L－WspR in E.coli

2.4 c－di－GMP存在性檢測(cè)

根據(jù) c－di－GMP的檢測(cè)步驟，當(dāng)加入血紅素時(shí)，pQE81L系列為無色，pQE81L－WspR系列為淺淺的紅綠色，如圖4所示；再加入吖啶黃時(shí)，pQE81L系列為淺淺的黃色，pQE81L－WspR系列為深黃色，如圖5所示；所有藥品加完時(shí)pQE81L系列為淺綠色，pQE81L－WspR系列為深綠色，如圖6所示.

上述實(shí)驗(yàn)經(jīng)多次反復(fù)操作，顏色變化保持一致，表明大腸桿菌BL21pQE81L－WspR參與合成了 c－di－GMP，并且c－di－GMP氧化ABTS 為ABTS＋離子，是整個(gè)溶液表現(xiàn)出ABTS＋離子的顏色，即綠色.而大腸桿菌BL21pQE81L雖然也合成了c－di－GMP，使溶液表現(xiàn)淡淡的淺綠色，但相比WspR基因存在下合成的量卻很少.

綜上所述，WspR受體蛋白能促進(jìn)大腸桿菌合成第二信使c－di－GMP，并且大大加速了c－di－GMP的合成量.

圖4 加入血紅素后的顏色變化Fig.4 The colour change after adding hemin

圖5 加入吖啶黃后的顏色變化 Fig.5 The colour change after adding acriflavine

圖6 加完ABTS和H2O2之后的顏色變化 Fig.6 The colour change after adding ABTS and H2O2

3 討 論

作為一個(gè)廣泛存在的第二信使－環(huán)二鳥苷酸（c－di－GMP），國內(nèi)外在有關(guān)代謝調(diào)控、細(xì)胞功能和信號(hào)傳導(dǎo)的作用等方面取得了重要的進(jìn)展［19－23］.但是目前對(duì)土壤農(nóng)桿菌 ATCC31749中c－di－GMP的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚，而我們通過研究驗(yàn)證WspR能在大腸桿菌中表達(dá)，并促進(jìn)cdi－GMP大量表達(dá)，這為下一步研究 WspR在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進(jìn)c－di－GMP合成提供基礎(chǔ)，進(jìn)而為可得膠合成提供一定的依據(jù).

雖然我們初步證實(shí)了WspR受體蛋白能在大腸桿菌中促進(jìn)c－di－GMP大量表達(dá)，但相關(guān)研究還有許多問題尚待解決：①合成c－di－GMP的影響因素、最佳條件、調(diào)控機(jī)制；②WspR能否在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中合成c－di－GMP并表達(dá)大量的胞外多糖可得膠；③尋找菌體內(nèi)c－di－GMP作用的靶點(diǎn)，但是還有許多細(xì)菌并不含有GEMM RNA，那么這些細(xì)菌中c－di－GMP第二信使傳導(dǎo)通路是否存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究.未來的研究中，鑒定新的c－di－GMP調(diào)控是我們迫切需要解決的問題.

4 結(jié) 論

綠膿桿菌中得到的類趨化系統(tǒng)蛋白 WspR在大腸桿菌BL21中順利促進(jìn)合成c－di－GMP，并且合成量能大大增加.而大腸桿菌是大量高效表達(dá)純化蛋白質(zhì)的模式菌株，這就為后期研究WspR受體蛋白在土壤農(nóng)桿菌ATCC31749中促進(jìn)合成c－di－GMP，進(jìn)而合成胞外多糖可得膠提供了確切可行的依據(jù).

［1］叢峰松，張洪斌，張維杰.可得膠及其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域上的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2004，25（11）：432－435.

［2］ZHANG H，NISHINARI K，WILLIAMS M A K，et al.A molecular description of the gelation mechanism of curdlan［J］.Mol Microbiol，2002，30（1）：7－16.

［3］LAROCHE1C，MICHAUD P.New developments and prospective applications forβ（1，3）glucans［J］.Recent Patents on Biotechnology，2007，1（1）：59－73.

［4］GOODRIDGE H S，WOLF A J，UNDERHILL D M.β－glucan recognition by the innate immune system［J］.Immunol Rev，2009，230（1）：38－50.

［5］JENAL U，MALONE J.Mechanisms of cyclic－di－GMP signaling in bacteria［J］.Annu Rev Genet，2006，40（2）：385－407.

［6］R?MLING U，AMIKAM D.Cyclic di－GMP as a second messenger［J］.Curr Opin Microbiol，2006，9（2）：218－228.

［7］RYAN R P，F(xiàn)OUHY Y，LUCEY J F，AND DOW J M.Cyclic di－GMP signaling in bacteria：recent advances and new puzzles［J］.Nat Rev Microbiol，2007，188（24）：8327－8344.

［8］TAMAYO R，TISCHLER A D，AND CAMILLI A.The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase［J］.Nat Rev Microbiol，2005，280（39）：33324－33330.

［9］DOW J M，CROSSMAN L，F(xiàn)INDLAY K，et al.Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell－cell signaling and is required for full virulence to plants［J］.Proc Natl Acad Sci USA，100（19）：10995－11000.

［10］ROSS P，WEINHOUSE H，ALONI Y，et al.Regulation of cellulose synthesis in Acetobacter xyli－num by cyclic diguanylate［J］.Nature，1987，325（6101）：279－281.

［11］SIMM R，MORR M，KADER A，et al.GGDEF and EAL domains inversely regulate cyclic di－GMP levels and transition from sessility to motility［J］.Mol Microbiol，2004，53（4）：1123－1134.

［12］Hengge R.Principles of c－di－GMP signalling in bacteria［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（4）：263－273.

［13］吳林.Shewanella oneidensis鞭毛組裝的分子特性及其非運(yùn)動(dòng)褶皺表型的形成機(jī)理［D］.杭州：浙江大學(xué)，2011.

［14］JENNIFER R，CONNOR O，NATHAN J K，et al.Surface sensing and lateral subcellular localization of WspA，the receptor in a chemosensory－like system leading to c－di－GMP［J］.Mol Microbiol，2012，86（3）：720－729.

［15］HICKMAN J W，HARWOOD C.dentification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c－di－GMP－responsive transcription factor［J］.Mol Microbiol，2008，69（2）：376－389.

［16］KARATAN E，WATNICK P.Signals，regulatory networks，and materials that build and break bacterial biofilms［J］.Microbio Mol Biol Rev，2009，73（2）：310－347.

［17］KRASTEVA P V，F(xiàn)ONG J C，SHIKUMA N J，et al.Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di－GMP［J］.Science，2010，327（5967）：866－868.

［18］于麗珺.土壤桿菌ATCC31749合成熱凝膠的氨調(diào)控機(jī)理及高產(chǎn)策略研究［D］.南京：江南大學(xué)，2011.

［19］NAKHAMCHIK A，WILDE C，ROWE－MAGNUS D A.Cyclic－di－GMP regulates extracellular polysaccharide production，biofilm formation，and rugose colony development by Vibrio vulnificus［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（13）：4199－4209.

［20］NAKAYAMA S，ROELOFS K，LEE V T，et al.A c－di－GMP－proflavine－h(huán)emin supramolecular complex has peroxidase activity－implication for a simple colorimetric detection［J］.Molecular BioSystems，2012，8（3）：726－729.

［21］SUNDRIYAL A，MASSA C，SAMORAY D，et.al.Inherent regulation of EAL domain－catalyzed hydrolysis of second messenger c－di－GMP［J］.J Biol.Chem，2014，289（18）：6978－6990.

［22］HENGGE R.Novel tricks played by the second messenger c－di－GMP in bacterial biofilm formation［J］.EMBO J，2013，32（3）：322－323.

［23］LINDENBERG S，KLAUCK G，PESAVENTO C.The EAL domain protein YciR acts as a trigger enzyme in a c－di－GMP signalling cascade in E.coli biofilm control［J］.EMBO J，2013，32（14）：2001－2014.