連翹苷含藥血清的制備及測定

任 杰，武果桃*，韓一超，孟冬霞，趙 娟，曹日亮，徐 芳，劉國敏，栗 艷

(1.山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032;2.沁源縣畜牧獸醫(yī)中心，山西沁源046500;3.長治市畜牧局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山西長治046000)

連翹具有廣譜抗病原微生物作用［1－3］。其主要活性成分連翹苷在抗菌、抗病毒、抗氧化和解熱抗炎等方面都起著重要作用［4］。連翹苷含藥血清的研究不但能揭示連翹苷及其代謝產(chǎn)物的藥理作用，而且能反映可能由連翹苷誘導機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，更接近其在體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的真實過程［5］。

研究旨在選用山西省道地中藥材連翹，對實驗動物兔進行灌胃，制備含藥血清，將含藥血清按一定色譜條件進樣分析，測定血清中主要活性成分連翹苷的含量;并與連翹標準品中的有效成分連翹苷進行對比。從中藥藥代動力學方面揭示連翹在動物體內(nèi)吸收和代謝，為連翹在臨床上的推廣應用提供了理論及試驗資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 離心機(sigma 2－16K)，LUMTECH高效液相色譜儀(UV DETECTOR K－2501檢測器，Autosampler進樣閥)，Eastchrom色譜工作站。

1.2 試劑 甲醇(色譜純)，上海陸忠試劑廠;95%甲醇(分析純)，江西同盟試劑化工廠;連翹苷對照品，中國藥品生物制品檢定所提供，批號:1108212200406，供含量測定用;連翹(連翹苷含量13.11 mg/g［6］)，山西雙鶴藥業(yè);連翹苷(含量 80%以上)，山西奧康動物保健公司。

1.3 實驗動物 健康家兔15只，山西醫(yī)科大學實驗動物中心，體重2.1 ～2.8 kg。

1.4 藥物制備

1.4.1 提取物的制備 稱取100 g連翹，將藥物放入藥鍋內(nèi)，加干凈的冷水浸泡藥物，加水量與藥物的比為10∶1，浸泡過夜。用大火將浸泡好的藥煮沸后，改用中、小火，維持藥物沸騰煎煮30 min，倒出藥液，重復煎煮一次，合并兩次藥液濃縮，干燥至粉末得到26 g提取物備用。

1.4.2 煎劑的制備 稱取100 g連翹，將藥物放入藥鍋內(nèi)，加干凈的冷水浸泡藥物，加水量與藥物的比為10∶1，浸泡過夜。用大火將浸泡好的藥煮沸后，改用中、小火，維持藥物沸騰煎煮30 min，倒出藥液，重復煎煮一次，合并兩次藥液濃縮至100 mL，4℃保存。

1.4.3 粗粉的制備 稱取100 g連翹，粉碎至粉末備用。

1.5 樣品處理

1.5.1 取15只家兔隨機分為5組，分別為提取物組(A組)，煎劑組(B組)，粗粉組(C組)，連翹苷組(D組)和空白對照組。給藥前禁食不禁水24 h，連續(xù)3 d給藥，每天兩次，給藥劑量A組1 g/d，B組4 mL/d，C 組4 g/d，D 組5 mg/d［7］。最后一次給藥后在0.5、1、1.5、2、4 h 采血，每試驗組各時間段血液混合放入離心管靜置3 h，4000 r/min離心取上清血清。分裝－20℃保存。

1.5.2 精密稱取連翹苷對照品 2.001 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻作為對照品儲備液.吸取該對照品溶液20 μL經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，作為對照品溶液［6］。

1.5.3 取含藥血清 100 μL 加 300 μL 乙腈渦旋2 min，10000 r/min離心 10 min，取上清液，氮氣吹干，用 100 μL 流動相溶解，0.45 μm 微孔濾膜過濾，作為測定樣品［8］。

1.6 HPLC測定連翹苷的方法學考察

1.6.1 色譜條件 色譜柱PT－230AColume heater Apollo C18 柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈－水 25∶75，流速 0.8 mL/min，檢測波長為235 nm，柱溫25℃。

1.6.2 線性關系試驗 精密吸取對照品溶液2、6、10、15、20 μL ，按上述色譜條件進樣，平行 3 次，測定連翹苷峰面積，以峰面積平均值(μV·s)對進樣量(μg)進行線性擬合，連翹苷的回歸方程為Y ＝ 2.36 × 105X+1.87 × 103，r=0.999。表明連翹苷進樣量在0.4～4.0 μg時，線性關系良好。

1.6.3 精密度試驗 精密吸取連翹苷對照品溶液10 μL進樣，重復5次，測得連翹苷峰面積相對標準偏差(RSD)為0.6%，表明儀器精密度良好。

1.6.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液，按上述色譜條件分別在1、3、5、7、12 h 進樣一次，計算，測得RSD為0.5%。證明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.6.5 重現(xiàn)性試驗 精密吸取供試品溶液樣品5份，每份10 μL進樣分析，測得連翹苷峰面積的RSD為1.4%(n=5)，表明該方法重現(xiàn)性好。

1.6.6 加樣回收率試驗 精密吸取已知連翹苷含量樣品5份，分別加入適量的連翹苷對照品，制備進樣溶液，進樣分析，連翹苷平均回收率為97.1%，RSD 為1.2%(n=5)，結果見表1。

表1 加樣回收率結果

2 測定結果

煎劑組(B組)和粗粉組(C組)在5個時間點都測不出連翹苷的含量，提取物組(A組)只有在1.5 h可以測到含量極低的連翹苷，連翹苷純品組(D 組)在 0.5、1、1.5、2、4 h 的連翹苷含量分別為:0.205、0.266、0.099、0.046、0 mg/mL。其測定結果見圖1－圖9。

圖1 標準品色譜圖

圖2 空白對照組色譜圖

圖3 A組1.5 h樣品色譜圖

圖4 B組樣品色譜圖

圖5 C組樣品色譜圖

圖6 D組樣品0.5 h色譜圖

圖7 D組樣品1 h色譜圖

圖8 D組樣品1.5 h色譜圖

圖9 D組樣品2 h色譜圖

3 討論

連翹成分復雜，血清中連翹苷含量很少，選擇恰當?shù)臏y定方法是本試驗關鍵。試驗經(jīng)過查資料和條件優(yōu)化對比得到試驗中的方法［9］，該方法簡便易行、靈敏度和準確度高，重現(xiàn)性好，適用于連翹苷的含量測定，也可用于中藥連翹的質(zhì)量控制。

連翹粗粉和煎劑中連翹苷的含量很低，再經(jīng)腸胃代謝，很難在血清中測到，提取物給藥所得含藥血清中連翹苷含量較低，所以作為分析用的連翹苷含藥血清用有效成分純品給藥效果最為理想。

針對連翹苷的含藥血清制備中，采血時間也應適當控制。蔣紅等發(fā)現(xiàn)制備銀翹天甘含藥血清時于最后一次給藥后31 min采得的含藥血清中連翹苷含量為最高［10］，而本試驗中30 min和1 h所測得數(shù)據(jù)基本接近.所以采血時間應在0.5～1 h以內(nèi)。董新榮等研究在給藥后3 h，血藥濃度即降到很低，隨后藥物濃度下降緩慢，此時血液和組織中的藥物基本上達到平衡，其藥物半衰期在3 h以上［11］。這與本試驗在4 h時已測不出連翹苷含量的結果相一致。另外在預試驗中發(fā)現(xiàn)動脈血比靜脈血的連翹苷含量高些。

［1］張海燕.連翹化學成分及藥理活性的研究進展［J］.中藥材，2000，23(10):657.

［2］劉 明.中藥連翹藥理作用的研究近況［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(16):2438.

［3］趙建平，張 玲，王世偉，等.連翹臨床新用簡介［J］.山西中醫(yī)，2004，20(6):53.

［4］厲世偉，司寧寧，李 龍，等.連翹有效成分對炎癥模型的作用［J］.中獸醫(yī)藥雜志，2012，31(1):16－19.

［5］崔曉蘭.中藥藥理研究的新思路—中藥血清藥理學［J］.中國中醫(yī)藥科技，1997.4(4):239.

［6］武果桃，劉紅霞，任 杰，等.HPLC法測定山西道地中藥連翹中連翹苷的含量［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，28(3):49－50.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版［S］.

［8］張君仁，藏恒昌.體內(nèi)藥物分析［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002:9.

［9］任 杰，姚敬明，武果桃，等.HPLC測定石榴皮提取物顆粒劑中不同時期鞣花酸含量的變化［J］.中國獸藥雜志，2012，46(2):30－32.

［10］蔣 紅，王宏軍，王春華，等.銀翹天甘醇提物含藥血清制備方法的研究［J］.動物醫(yī)學進展.2012，33(3):37－42.

［11］董新榮，郝圣峰，葛 銘，等.復方制劑中連翹苷的藥物動力學試驗［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45(3):80－81.