鯉魚肺炎克雷伯氏菌分離與鑒定

盧玉婷，鄭丹丹，胡揚揚，張雅斌，張培軍，李月紅* ，冷東澤

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，長春130118;3.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，長春130000;4.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，長春130000)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科腸道桿菌屬，廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及水、土壤中。肺炎克雷伯氏菌是當前危害動物和人類最為嚴重的條件致病菌之一［1］，肺炎克雷伯氏菌分布廣泛，最先從大葉性肺炎病人的肺組織中分離到，當機體免疫力降低或長期服用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時易引起感染，若治療不當則死亡率極高［2］。隨著我國特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，該病對毛皮動物和人類的危害日益嚴重，曾多次報道該病在人和動物中的發(fā)生和流行［3］。1999年至2002年北京、廣東、湖北和遼寧地區(qū)41家三級甲等醫(yī)院均出現(xiàn)人感染肺炎克雷伯氏菌疾病的案例［4］。該菌寄生在動物體內(nèi)，也造成了養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失。2006年周玉龍［5］做了奶牛感染肺炎克雷伯氏菌后急性死亡的研究。2012年王孝友［6］從患病兔體內(nèi)分離出肺炎克雷伯氏菌。而該菌對水生動物危害的報道很少，對鯉魚更是鮮有報道。1992年Singh［7］在海水魚、淡水魚等水產(chǎn)品中檢測到肺炎克雷伯氏菌;2007年唐毅［8］從發(fā)病白鰱肝臟和鰓部分離出肺炎克雷伯氏菌。2009年鄧國成［9］從發(fā)病鰻魚體內(nèi)分離出肺炎克雷伯菌。目前尚未有研究性文獻明確該菌對鯉魚的危害。本試驗首次從患病鯉魚上分離到肺炎克雷伯氏菌，建立了該菌對鯉魚的發(fā)病模型，對其進行耐藥性測試并篩選了防治藥物，為預(yù)防和治療肺炎克雷伯氏菌引起的鯉科魚類疾病提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗病魚來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藍湖，病魚鰓后緣、腹鰭基部、臀鰭基部、生殖口處均出現(xiàn)充血現(xiàn)象，部分魚腹部出現(xiàn)潰爛癥狀。魚鰓部微白。解剖病魚，有嚴重腥臭味腹水流出，腸道、肝胰臟、脾臟等處均出現(xiàn)充血癥狀，部分魚肌肉充血，膽囊腫大。

1.2 試驗儀器及試劑 150G全溫振蕩培養(yǎng)箱(金壇市國旺實驗儀器廠);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9101-OSA型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng);革蘭氏染色試劑盒(上海銘睿生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化 在無菌條件下進行患病鯉魚鰓和肝胰臟組織的采取，用研缽碾碎后制成組織懸液，用接種環(huán)挑取組織液在普通瓊脂平板上劃線，在37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。挑取形態(tài)和結(jié)構(gòu)，顏色相同的單個菌落在普通瓊脂平板上劃線分離純化，待菌落成單個均勻分布，挑取單個菌落采用甘油保藏法保存。

1.3.2 病原菌的鑒定

1.3.2.1 革蘭氏染色法 在潔凈的載玻片上滴一滴生理鹽水，將分離純化的細菌在無菌條件下用接種環(huán)挑取單個菌落，均勻涂布于生理鹽水中干燥固定，經(jīng)結(jié)晶紫染色、碘染、酒精脫色、蕃紅染色后鏡檢。

1.3.2.2 生化鑒定 采用PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌鑒定系統(tǒng)，鑒定板為革蘭氏陰性菌鑒定板，51孔，試驗周期15 h結(jié)束后觀察實驗結(jié)果并分析。

1.3.2.3 藥物敏感試驗 采用PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌藥敏檢測系統(tǒng)，鑒定板為革蘭氏陰性菌藥敏板，85孔，試驗周期15 h結(jié)束后觀察試驗結(jié)果并分析。

1.3.2.4 回歸試驗 取體格健壯、游動活躍的黃河鯉魚192條，平均規(guī)格200 g左右。隨機分為4組，分別為試驗組1，試驗組2，試驗組3和對照組，每組48條。將4組魚同時放入相同水環(huán)境不同魚缸中(浴缸規(guī)格為80 cm×60 cm×100 cm)，30℃暫養(yǎng)一周。待魚基本穩(wěn)定后，試驗組每條魚用腹腔注射法注射菌液(培養(yǎng)液為普通肉湯)0.5mL，對照組每條魚注射相同無菌普通肉湯培養(yǎng)液0.5 mL。30℃水溫下飼養(yǎng)7 d，觀察魚體變化，并記錄。

1.3.2.5 細菌的分離鑒定 對1.3.2.4中發(fā)病魚進行細菌分離培養(yǎng)，方法同1.3.1。對分離出的細菌進行革蘭氏染色和生理生化檢驗，分析結(jié)果。

2 試驗結(jié)果

2.1 革蘭氏染色結(jié)果 革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察到短桿狀、紅色細菌，單個存在或2個相連(見圖1)，表明該細菌呈革蘭氏陰性.來自于鯉魚肝臟和鰓部分離的菌株具有相同的菌體特征。

圖1 革蘭氏染色鏡下圖

2.2 生化鑒定結(jié)果 如表1可知該菌與七葉苷、PNP-BD-糖苷、Beta-葡二糖等反應(yīng)呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質(zhì);而與戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC、黏菌素、4MU-N-乙酰-BD-氨基葡萄甘等反應(yīng)呈陰性。

2.3 藥物敏感試驗結(jié)果 如表2所示，可知該菌對亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等高度敏感，對氨芐西林耐藥性最強。

表2 藥敏試驗結(jié)果

2.4 回歸試驗結(jié)果 在注射菌液36 h后，魚吃食量明顯下降甚至不吃食。48 h之后部分魚開始死亡。試驗周期結(jié)束后，試驗組三個魚缸均出現(xiàn)不同數(shù)量發(fā)病死魚，而對照組魚無發(fā)病死亡出現(xiàn)(見表3)。

觀察死亡魚，發(fā)現(xiàn)其體表有明顯充血塊，尤其是在胸鰭、腹鰭和生殖口處明顯，部分魚體腹鰭基部出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象。解剖病魚有濃烈腥臭味的腹水流出，魚內(nèi)臟嚴重充血，肝胰臟、脾臟及腸道均出現(xiàn)明顯充血現(xiàn)象。

2.5 細菌的分離鑒定結(jié)果 根據(jù)上述革蘭氏染色反應(yīng)及生理生化檢驗，得到細菌的特征與上述分離的肺炎克雷伯氏菌的特征完全相符。

表3 回歸試驗結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本試驗首次從發(fā)病鯉魚體內(nèi)分離出肺炎克雷伯氏菌。該菌使鯉魚發(fā)病，表現(xiàn)出身體大部分充血，部分魚腹部出現(xiàn)潰爛癥狀，魚鰓部微白。解剖病魚，有嚴重腥臭味腹水流出，內(nèi)臟多處出現(xiàn)充血癥狀，部分魚肌肉充血，膽囊腫大。此發(fā)病現(xiàn)象與唐毅［8］等人研究的白鰱感染該菌的癥狀相似。

從革蘭氏染色結(jié)果來看，該菌在顯微鏡下呈現(xiàn)短桿狀、紅色，單個存在或2個相連，此結(jié)果和徐海圣［10］的基本相同。生化鑒定結(jié)果中得到該菌與七葉苷、PNP-BD-糖苷、Beta-葡二糖等反應(yīng)呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質(zhì);與戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC、黏菌素、4MU-N-乙酰-BD-氨基葡萄甘等反應(yīng)呈陰性。

人患克雷伯氏菌肺炎較一般肺炎病情重，對一般肺炎常用的首選藥物青霉素無效［11］。大量的流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，近年來由于各種抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致肺炎克雷伯氏菌耐藥性普遍存在，且多數(shù)的分離株都為多重抗藥性的菌種，耐藥性日趨嚴重，其耐藥機制又較復(fù)雜，在治療上造成極大的困擾［12］。本試驗所做的肺炎克雷伯氏菌藥物敏感試驗，分離出了一些高度敏感的藥物:亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、左氧氟沙星、黏菌素和環(huán)丙沙星。說明該菌對這些藥物十分敏感，這對開發(fā)治療由肺炎克雷伯菌引起的疾病有很好的幫助作用［13］，此結(jié)果和張芬［14］等人的研究結(jié)果基本一致。而該菌對氨芐西林產(chǎn)生耐藥性，說明該菌對氨芐西林已經(jīng)產(chǎn)生抵抗能力，繼續(xù)使用該藥物已經(jīng)達不到良好的效果。

本試驗所進行的試驗最終確定該病原菌為肺炎克雷伯氏菌。藥敏試驗結(jié)果分離出幾種高度敏感的藥物，為治療和預(yù)防該菌對鯉魚的危害提供可靠實驗數(shù)據(jù)和依據(jù)。因鯉魚感染肺炎克雷伯菌的研究較少，一些具體的發(fā)病機制和毒力基因等方面的研究仍需要進一步探究。

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