超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)清瘟敗毒散中非法添加金剛烷胺的研究

劉雪紅，董紫凌，韓鳳麗，鄭 潔，馬慧楠，宋 平，田曉玲

（1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037；2.遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽110000）

金剛烷胺（Amantadine），又名三環(huán)癸胺、三環(huán)葵胺，為一種對(duì)稱的三環(huán)狀胺，分子式：C10H17N，分子量：151.25［1］。它可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞，并影響病毒的脫殼，抑制其繁殖，起治療和預(yù)防病毒性感染作用，是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥。國內(nèi)主要將金剛烷胺用于雞、豬流感的預(yù)防和早期治療，以及豬傳染性胃腸炎的防治。金剛烷胺作為人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效試驗(yàn)數(shù)據(jù)；用于動(dòng)物病毒性疫病會(huì)給動(dòng)物疫病控制帶來不良后果，影響國家動(dòng)物疫病防控政策的實(shí)施［2］；在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)人體具有潛在危害，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)受刺激或中毒，嚴(yán)重者出現(xiàn)充血性心力衰竭。2005年農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告規(guī)定禁止生產(chǎn)、使用金剛烷胺獸用原料藥及其制劑。金剛烷胺因其良好的治療和預(yù)防病毒性感染作用，常被添加到一些獸用中藥制劑中，以增加中藥制劑的治療效果，并且針對(duì)清瘟敗毒散中非法添加金剛烷胺的檢測(cè)方法未見報(bào)道，因此，本文對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD-200，德國Sartorius公司；超聲波清洗機(jī)；離心機(jī)RJ-TDL-40B；渦旋振蕩器；XEVO TQ-S ACQUITY UPLC超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司；色譜柱 BEH C18 2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 金剛烷胺 00001381-1951，含量99.0%，北京振翔公司；鹽酸金剛烷胺，批號(hào)100426-200301，含量99.0%，中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 陰性對(duì)照散劑 清瘟敗毒散：本溪嘉德生物科技有限公司，經(jīng)檢測(cè)不含金剛烷胺。

1.2.2.2 陽性添加散劑 分別按照1、5、10 mg／g的比例在陰性對(duì)照散劑中添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品（鹽酸金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品），混勻。

1.2.3 試劑 甲醇色譜純、甲醇分析純、甲酸分析純、水為符合GB／T 6682-1992規(guī)定的一級(jí)水。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，以甲醇定容至25 mL，混勻，即為1000 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；-25℃保存，有效期為3個(gè)月。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 精密量取1.2.4項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL置100 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度?；靹?，制成濃度為10 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.6 提取液配制 甲醇 ∶水＝50∶50。

1.2.7 稀釋液配制 甲醇∶水∶甲酸＝10∶90∶0.2。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 樣品處理 精密稱取中獸藥散劑1 g，置于100 mL聚乙烯離心管中，加提取液50 mL，超聲10 min，離心 5 min（4000 r／min）；精密移取上清液1 mL加提取液，定容至100 mL；精密移取1 mL加稀釋液1.2.7，定容至100 mL，過0.22 μm濾膜后供測(cè)定用。

1.3.2 液相色譜條件 柱溫：30℃，進(jìn)樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式：正離子，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，霧化器壓力：7.0 Bar，干燥氣流量：850 L／h，干燥氣溫度：550 ℃，毛細(xì)管電壓：3000 V。

定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液1.2.5逐級(jí)稀釋，以稀釋液1.2.7定容配制成濃度分別為0.05、0.2、1、5、25 ng／mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，混勻后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（ng／mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，藥物的回歸方程為y＝64+96230x，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9998。從回歸方程及相關(guān)系數(shù)可以看出金剛烷胺在0.05～25 ng／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 檢測(cè)限和定量限 陰性對(duì)照散劑按1.3.1的方法步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試料對(duì)所測(cè)藥物無干擾?？瞻谆|(zhì)譜圖見圖1。 添加 1000 μg／mL 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 100 μL于1 g空白試料中，經(jīng)提取后測(cè)定，金剛烷胺的信躁比均 S／N＞10，表示方法的定量限為 0.1 mg／g。 添加1000 μg／mL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 25 μL 于1 g空白試料中，經(jīng)提取后測(cè)定，金剛烷胺的信躁比均S／N＞3，表示方法的檢測(cè)限為 0.025 mg／g。

圖1 空白基質(zhì)譜圖

2.3 精密度試驗(yàn) 取1 ng／mL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5 μL，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明6次重復(fù)進(jìn)樣的RSD為0.2%，外標(biāo)法測(cè)定金剛烷胺具有良好的重現(xiàn)性。1 ng／mL標(biāo)液中金剛烷胺特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

2.4 回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白試料中添加 3 個(gè)不同濃度（1、5、10 mg／g）金剛烷胺進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。從表中試驗(yàn)結(jié)果可以看出本方法的回收率為86.9%～95.2%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.8%。

圖2 金剛烷胺特征離子質(zhì)量色譜圖

表3 添加不同濃度金剛烷胺回收率及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 （n＝5）

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述2.4項(xiàng)下制備的供試液，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明，樣品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)方法的選擇 金剛烷胺的分子結(jié)構(gòu)缺少生色基團(tuán)，且由于結(jié)構(gòu)中有伯胺基而不易揮發(fā)，文獻(xiàn)中多采用柱前衍生化后GC測(cè)定，其中的衍生化過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)［3］。HPLC-放射免疫法，專屬性較低［4］。容量分析法，無論是以高氯酸為滴定溶液的非水滴定法［1］或以氫氧化鈉為滴定溶液的雙相滴定法［5］，均以溶液顏色變化指示終點(diǎn)，而中藥散劑配成溶液，本身顏色較深，干擾測(cè)定。本文采用的LC／MS／MS法，靈敏度高、選擇性強(qiáng)；且在該色譜條件下，不到3 min便可將樣品中的金剛烷胺檢測(cè)，測(cè)試快速，分析周期短。

3.2 提取溶劑的選擇 根據(jù)鹽酸金剛烷胺溶于水而金剛烷胺溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，考慮到非法添加物是原料藥鹽酸金剛烷胺或金剛烷胺，采用50%的甲醇水溶液，兩種原料藥均可完全溶解，保證添加物質(zhì)提取完全。

3.3 樣品處理方法的選擇 中藥散劑與肌肉、肝、血液等樣品相比，無蛋白及脂肪的干擾，無需過固相萃取柱凈化［6-7］。且中獸藥散劑添加量較大，無需濃縮。按本文方法處理樣品，無基質(zhì)干擾，方法簡(jiǎn)單、快速，回收率高。

3.4 添加回收率試驗(yàn)濃度的選擇 根據(jù)此中獸藥散劑在預(yù)防和治療畜禽的用量及臨床中金剛烷胺的預(yù)防和治療的用量，選擇添加1、5、10 mg／g金剛烷胺作為添加回收試驗(yàn)濃度，符合非法添加的實(shí)際情況，測(cè)定回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.5 中獸藥散劑種類的選擇 清瘟敗毒散具有清熱解毒、瀉火涼血、抑菌抗病毒等功效。用于治療禽流行性感冒、傳染性法氏囊炎、新城疫、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎等。金剛烷胺可以抑制病毒穿入宿主細(xì)胞，并影響病毒的脫殼，抑制其繁殖，起治療和預(yù)防病毒性感染作用，在畜禽養(yǎng)殖中極可能被添加到中獸藥散劑中增強(qiáng)抗病毒療效。故選清瘟敗毒散作為檢測(cè)對(duì)象。

本研究確立的用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，可檢測(cè)獸用中藥制劑清瘟敗毒散中非法添加的金剛烷胺。檢測(cè)限及定量限均能滿足要求。樣品處理簡(jiǎn)單，快速，檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典二○○五年版二部［S］.

［2］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第560號(hào)［S］.

［3］Sioufi A， Pommier F.Gas chromatographic determination of amantadine hydrochloride in human plasma and urine［J］.ChromatograB，1980， 183（1）： 33.

［4］Midha K K ，Rauw G，Mckay，et al.Subnanogram quantitation of chlorpheniramine in plasma by a new radiocommanoassay and comparison with a liquld chromatographic method ［J］.Jpham Sci.1984，73（8）：1144.

［5］涂 瓊，吳澄清，盧慶紅.雙相滴定法測(cè)定金剛烷胺合劑的含量［J］.兒科藥學(xué)雜志，2004， 10 （4）：45-46.

［6］李士敏，王 瑋.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中鹽酸金剛烷胺濃度及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究［J］.藥物分析雜志，2007，01：66-68.

［7］DB32／T 1163-2007雞肝中金剛烷胺殘留量的測(cè)定-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.