高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B注射液中4種維生素的含量

陸春波，穆 琳，蔡文金

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州310020）

復(fù)合維生素B注射液為復(fù)方制劑，主要用于防治維生素缺乏所致的多發(fā)性神經(jīng)炎，消化障礙，癩皮病，口腔炎等。復(fù)合維生素B注射液收載于農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告［1］，該標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)維生素 B1、核黃素磷酸鈉的含量進(jìn)行了測(cè)定，其中維生素B1測(cè)定方法為重量法，核黃素磷酸鈉測(cè)定方法為紫外-可見分光光度法。本研究在參考文獻(xiàn)［2-4］的基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定本品中維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺含量的方法，結(jié)果較為滿意。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜，配Waters 2487紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；XS-205電子天平（Mettler公司）。

1.2 試劑 甲醇、冰醋酸、庚烷磺酸鈉為色譜純；三乙胺為分析純；水為超純水。

1.3 對(duì)照品 維生素B1對(duì)照品，批號(hào)為00311，含量為95.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；核黃素磷酸鈉對(duì)照品，批號(hào)為SLBD2777V，含量（以維生素B2計(jì)）為70.0%，SIGMA-ALDRICH公司；維生素B2對(duì)照品，批號(hào)為 11021，含量為 99.2%，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司；維生素B6鹽酸鹽對(duì)照品，批號(hào)為11020，含量為100.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；煙酰胺對(duì)照品，批號(hào)為 100115-200703，含量為99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。泛酸鈣對(duì)照品，批號(hào)為100370-200301，供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 供試品 復(fù)合維生素B注射液，規(guī)格為10 mL，含維生素B1100 mg、核黃素磷酸鈉13.7 mg（以維生素B2計(jì)10 mg）、維生素 B610 mg和煙酰胺150 mg， 批號(hào)分別為20140301、20140302、20140303，均由浙江金力制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取維生素B1對(duì)照品約100 mg，核黃素磷酸鈉對(duì)照品約10 mg，維生素B6鹽酸鹽對(duì)照品約10 mg和煙酰胺約150 mg，精密稱定，置同一25 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.4 空白溶液的制備 取泛酸鈣對(duì)照品50 mg，加水至100 mL，作為空白供試品；精密量取1 mL，置25 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，作為空白溶液。

2.2 高效液相色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相 A：三乙胺-冰醋酸-甲醇-0.015 mol／L庚烷磺酸鈉（0.2 ∶7.5 ∶75∶820），流動(dòng)相 B：甲醇，梯度洗脫（表1）；檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm；流速 1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度參數(shù)

2.3 線性考察 精密量取 1、2、3、5、10 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別置50 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分析，以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表2。

圖1 核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

表2 維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺線性結(jié)果

2.4 專屬性考察 按2.2項(xiàng)色譜條件，分別對(duì)混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液進(jìn)行分析（結(jié)果見圖1、圖2、圖3）。結(jié)果表明：空白溶液在核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1峰處無(wú)吸收峰，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1的理論板數(shù)均大于3000，核黃素磷酸鈉與煙酰胺分離度為6.6；煙酰胺與維生素B6分離度為15.7；維生素B6與維生素B1分離度為16.5。

用維生素B2對(duì)照品代替核黃素磷酸鈉對(duì)照品，配制方法同2.1.1項(xiàng)和2.1.2項(xiàng)，液相色譜圖如圖4所示。

圖3 空白溶液HPLC色譜圖

圖4 煙酰胺、維生素B2、維生素B6、維生素B1混和對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

2.5 回收率試驗(yàn) 取維生素B1、核黃素磷酸鈉、維生素B6、煙酰胺對(duì)照品適量，用空白供試品溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為添加樣品，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度。每個(gè)濃度各制備3份平行樣，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1的 RSD分別為0.3%，0.3%，0.2%，0.2%。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1的 RSD分別為 0.5%，0.3%，0.2%，0.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品測(cè)定 取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素B6、維生素B1對(duì)照品適量，用流動(dòng)相A溶解后，在400～200 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，核黃素磷酸鈉、煙酰胺、維生素 B6、維生素 B1分別在 267、261、291、246 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，綜合考慮，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相中加入三乙胺，可以消除堿性物質(zhì)的拖尾現(xiàn)象，特別對(duì)于含有叔胺結(jié)構(gòu)的維生素B1更有明顯的作用。曾用流動(dòng)相A作等度洗脫，維生素B1的出峰時(shí)間過長(zhǎng)，為了縮短分析時(shí)間，選擇了梯度洗脫。

3.3 農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告方法的不足之處 農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告關(guān)于復(fù)合維生素B注射液中的維生素B1、核黃素磷酸鈉的含量測(cè)定方法采用的是重量法和紫外-可見分光光度法。重量法測(cè)定維生素B1的操作較為復(fù)雜；采用的垂熔玻璃坩堝的號(hào)數(shù)對(duì)結(jié)果影響較大；且洗滌溶劑丙酮對(duì)人體有危害。紫外-可見分光光度法測(cè)定核黃素磷酸鈉，如果有維生素B2的干擾，核黃素磷酸鈉和維生素B2均有吸收，用該方法測(cè)定的應(yīng)為兩者之和。

本文對(duì)色譜條件、方法線性、專屬性、回收率和重復(fù)性等方面進(jìn)行考察后，建立了高效液相色譜法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，能有效檢測(cè)復(fù)合維生素B注射液中4種維生素的含量。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).農(nóng)業(yè)部1960號(hào)公告.獸用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品、中藥卷）第一冊(cè)［S］.

［2］李祥勝，闞家義.復(fù)合維生素B注射液中4種維生素的含量測(cè)定［J］.安徽醫(yī)藥，2009， 13（7）： 755-756.

［3］周 杰，梁建軍，王晨光.復(fù)合維生素B注射液的含量測(cè)定［J］.河北化工， 2007，30（4）： 46-47.

［4］陳光龍，李玉蘭，劉 敏，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片中4種組分的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006， 26（10）： 1256-1258.