鹽酸多西環(huán)素注射液最穩(wěn)定pH值研究

胡海燕，王亦琳，黃耀凌，徐 倩，徐士新，朱馨樂，朱明文

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

鹽酸多西環(huán)素（Doxycycline Hydrochloride）為四環(huán)素類廣譜抗生素，其抗菌活性強于土霉素和四環(huán)素，在獸醫(yī)臨床上有廣泛應用。但該藥結構中含有酚羥基、烯醇基和酰胺基等易氧化水解基團，導致了其在水溶液中的不穩(wěn)定性質(zhì)并由此而成為注射液制備的難點。為此，選擇適宜的方法阻止或延緩不穩(wěn)定因素的發(fā)生，尋找一個相對穩(wěn)定的最佳條件是注射液制備的關鍵，而其中pH值是影響注射液穩(wěn)定性的重要因素之一。調(diào)節(jié)適當?shù)膒H值可起到延緩藥物水解和氧化的作用。目前，農(nóng)業(yè)部頒布的獸藥質(zhì)量標準中，鹽酸多西環(huán)素注射液的pH值有不同的控制要求［1-2］，這與產(chǎn)品的配方及自身特點有關。不同配方的產(chǎn)品往往因pH值的不同而呈現(xiàn)穩(wěn)定性的差異。為此，研究探討pH值與穩(wěn)定性之間的關系，確定最穩(wěn)定pH值及其控制范圍是注射液研制的重要環(huán)節(jié)，但目前以化學動力學的方法系統(tǒng)地開展穩(wěn)定pH值的研究在獸藥領域未見報道。本文采用化學動力學方法對所研制的鹽酸多西環(huán)素注射液進行了穩(wěn)定pH值研究，探討和比較了經(jīng)典恒溫法和單測點法的應用，為預測產(chǎn)品穩(wěn)定pH值及其范圍，簡化試驗方法，提高藥物的穩(wěn)定性和安全性提供理論依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 試藥 鹽酸多西環(huán)素（按無水無乙醇物計算，含量97.2%，批號1001803，石家莊華曙善合藥業(yè)有限公司）；氧化鎂（含量98.1%，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；鹽酸多西環(huán)素對照品（含量85.2%，批號K0131001，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；土霉素對照品（含量92.4%，批號K0030712，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；美他環(huán)素對照品（含量88.5%，批號30499-200802，中國藥品生物制品檢定所）；β-多西環(huán)素對照品（批號130405-200405，中國藥品生物制品檢定所）；化學試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配2487紫外檢測器，Waters公司；LHH-150 SD型藥品穩(wěn)定性試驗箱，上海一恒科學儀器有限公司；Memmert UM300烘箱，上海Memmert有限公司；EMS-20恒溫水浴，常州諾基儀器有限公司；PL202-L電子天平，METTLER TOLEDO 公司；IKA RH basic KT／C磁力攪拌器，IKA公司；FE20酸度計，METTLER TOLEDO公司。

2 方法

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱phenomenex Luna C18 4.6 mm×250 mm 5 μm；流動相：0.05 mol／L 草酸銨溶液-二甲基甲酰胺-0.2 mol／L磷酸氫二銨溶液（65∶30 ∶5）用氨試液調(diào)節(jié) pH 值至 8.0±0.2；柱溫35℃；流速 1.0 mL／L；檢測波長 280 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗 精密稱取土霉素（oxy），美他環(huán)素（meta），β-多西環(huán)素（beta-Doxy）和鹽酸多西環(huán)素（Doxy）對照品適量，按文獻［2］方法和要求進行試驗及判定。結果見表1、圖1、圖2。

2.1.3 標準曲線 精密稱取鹽酸多西環(huán)素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為2 mg／mL的標準溶液。精密量取標準溶液用0.01 mol／L的鹽酸溶液分別制成濃度為 2.5、5、15、40、80、100、200、400 μg／mL的對照溶液。按2.1.1項下條件測定。以對照溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

2.2 供試品的制備 按20%鹽酸多西環(huán)素注射液的處方量稱取鹽酸多西環(huán)素、氧化鎂及其他附加劑，在有機溶劑和注射用水組成的復合溶媒中加熱溶解后，降至室溫，用鹽酸或乙醇胺調(diào)節(jié)藥液至pH 2.0～8.0范圍內(nèi)的不同設定值，過濾，灌裝于5 mL棕色西林瓶中，加蓋密封，制成系列不同pH值的注射液樣品，備用。

2.3 恒溫加速試驗

2.3.1 經(jīng)典法 將不同pH值的注射液樣品置于若干恒溫條件下加速分解，間隔一定時間取樣，測得不同時間（t）藥物濃度（C）的變化數(shù)據(jù)，以化學動力學方法進行數(shù)據(jù)處理，考察加熱條件下藥物含量與時間的關系，求出各pH樣品的速率常數(shù)（k），以logk對 pH作圖，用圖解法及相關參數(shù)判定結果。

2.3.1.1 確定反應級數(shù) 取pH 3.8的鹽酸多西環(huán)素注射液樣品，分別置40、60、80、90℃四個恒溫條件下，于設定的不同時間點間隔取樣，按2.1.1項下色譜條件測定，以藥物相對百分含量（C%）的對數(shù)為縱坐標（y），以時間（t）為橫坐標（x）作各溫度下樣品的logC-t圖，考察多西環(huán)素含量與熱時間關系，擬合線性回歸方程，以其圖解法進行反應級數(shù)的判定。結果表觀反應級數(shù)基本呈一級反應（表 2、圖3）。

2.3.1.2 預測（pH）m 取2.2項配制的7個不同pH值樣品，置60℃和80℃恒溫條件下考察，于設定的間隔時間點取樣測定，以各樣品相對百分含量的對數(shù)logC（y）對時間t（x）作線性回歸，得兩個溫度下各pH的直線方程，以公式1：k＝-2.303×斜率計算速率常數(shù)（k）并與相應的pH值作logk-pH圖，進行（pH）m預測。其k值愈小，說明藥物分解速度愈慢。pH-速度圖（logk-pH圖）最低點（最小值）聯(lián)于橫坐標即為最穩(wěn)定 pH值［3］。結果見表 3～表4、圖4～圖5。

2.3.2 單測點法 將不同pH值的注射液樣品置若干恒溫條件下加速分解，在一個設定時間點取樣測定藥物含量，與考察前測定的初濃度（設定為0時間點）比較，以公式 2：k＝ 2.303／t×logC0／Ct（k 為速率常數(shù)，C0為初濃度，Ct為時間t的藥物濃度，t為取樣時間）計算各pH樣品的速率常數(shù)，作pH-速度圖，以圖解法及相關參數(shù)判定結果。

2.3.2.1 預測（pH）m 在2.3.1.2項試驗中，7個不同pH的樣品，在60℃恒溫條件下考察，分別取0、7 d各樣品的測定數(shù)據(jù)（表3），根據(jù)2.3.2項公式2計算k值，作logk-pH圖。結果見表5和圖6。

2.3.2.2 預測（pH）m及其范圍 選取2.2項配制的不同pH值樣品，分組置60℃和80℃條件下考察，于0、10 d取樣測定含量，以公式2計算，求出不同pH樣品的k值，以logk對pH作圖，依據(jù)k值和圖中顯示的最小值區(qū)域，確定（pH）m范圍。結果見表6、圖7。

3 結果

3.1 系統(tǒng)適應性試驗 結果（表1、圖1、圖2）表明：各峰分離度良好，實際理論塔板數(shù)符合要求。

表1 系統(tǒng)適用性實驗數(shù)據(jù)

圖1 混標（80 μg／mL）溶液色譜圖

圖2 鹽酸多西環(huán)素（Doxy）色譜圖

3.2 標準曲線 鹽酸多西環(huán)素線性回歸方程為y＝34468x-11410，相關系數(shù)為 0.9998 ，在 2.5～400 μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關系。其色譜條件滿足產(chǎn)品的測定要求。

3.3 反應級數(shù) 由表2和圖3可知四個溫度下鹽酸多西環(huán)素的 logC-t為線性關系，R2值均大于0.95，相關性良好。其降解基本呈一級反應。

表2 鹽酸多西環(huán)素注射液（pH 3.8）不同溫度下測定結果及線性關系

3.4 穩(wěn)定pH值（經(jīng)典法） 由60℃考察結果表3看出，pH值為4.0時，速率常數(shù)k值最小，其次為pH 5.3和pH 3.2，說明在此范圍內(nèi)鹽酸多西環(huán)素注射液降解緩慢。圖4顯示pH 4.0時出現(xiàn)極小值，即表明，最穩(wěn)定pH值為4.0。此外，在pH 8.0處還出現(xiàn)一個相對低點，說明鹽酸多西環(huán)素注射液在此條件下出現(xiàn)減緩降解趨勢。另外表4和圖5顯示80℃考察的結果與上基本一致，但相同pH條件下的速率常數(shù)均大于前者，曲線趨于平緩，表明：隨著溫度升高，藥物的降解反應增大。

圖3 pH 3.8鹽酸多西環(huán)素含量與熱時間關系曲線

表3 60℃條件下不同pH值樣品的線性方程及速率常數(shù)

表4 80℃條件下不同pH值樣品的線性方程及速率常數(shù)

圖4 60℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（經(jīng)典法）

圖5 80℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（經(jīng)典法）

3.5 穩(wěn)定pH值（單側點法） 從60℃考察的不同pH條件下的速率常數(shù)（表5）和pH-速度圖（圖6）看出，pH 4.0為最穩(wěn)定pH值，與2.3.1項經(jīng)典法預測結果相同。

表5 單測點法得到不同pH樣品的速率常數(shù)

圖6 60℃鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度圖（單測點法）

3.6 （pH）m及穩(wěn)定pH范圍 由表6可以看出，pH在2.0～7.0范圍內(nèi)經(jīng)60℃單測點考察，在pH 3.8和4.2時，k值最小，說明穩(wěn)定pH值在3.8至4.2之間，其次是pH 4.5和3.5。在此pH范圍內(nèi)80℃考察結果顯示pH 4.0時，k值最小。圖7直觀地顯示了兩個溫度下的趨勢線形態(tài)，其最小值在4.0，最小值區(qū)域在3.0～5.0之間。80℃時的趨勢線位于60℃趨勢線上方，說明隨著溫度上升，注射液的不穩(wěn)定性增大。

表6 鹽酸多西環(huán)素注射液不同pH值樣品高溫考察試驗結果

4 結論與討論

4.1 降解反應規(guī)律考察 為了解藥物降解情況，探討其降解規(guī)律，合理設計實驗方案，本文進行了四個不同溫度下多西環(huán)素濃度的對數(shù)與時間的線性關系考察，并對2.3.1.2項試驗中7個不同pH值樣品在規(guī)定［4］要求的高溫（60℃）條件下進行鹽酸多西環(huán)素注射液降解零級、一級和二級反應擬合，結果，在四個高溫條件和pH 3.2～8.0范圍內(nèi)基本符合一級反應特征。

圖7 鹽酸多西環(huán)素注射液pH-速度趨勢圖（單測點法）

4.2 （pH）m及其范圍的確定 為了延緩藥物降解，需要找出最穩(wěn)定pH范圍。通過60℃和80℃兩個恒溫條件下的加速試驗，以經(jīng)典法和單側點法同時考察處理，結合該注射液不同pH值對氧化性和溶解性的影響試驗得出：pH值在3.0～4.0時鹽酸多西環(huán)素溶解度大，抗氧化能力較強；在中性條件下溶解度小，偏堿條件下易氧化變色的結果，綜合確定本方法制備的鹽酸多西環(huán)素注射液最穩(wěn)定pH值為4.0，注射液pH值控制在3.0～5.0之間，生產(chǎn)pH值控制在3.8～4.2之間。

該注射液對熱敏感，生產(chǎn)中要把握關鍵控制點，嚴格控制溫度和pH值以保證產(chǎn)品質(zhì)量。

在該pH控制條件下制備的鹽酸多西環(huán)素注射液經(jīng)規(guī)定的［4］穩(wěn)定性考察，各項指標符合規(guī)定，穩(wěn)定性良好，有效期兩年。

4.3 簡化預測方法的探討 藥物穩(wěn)定性及（pH）m預測的常用方法為恒溫加速試驗法，即經(jīng)典法，該方法準確可靠，但工作量大，時間長，數(shù)據(jù)處理繁瑣，試驗成本高，為此，出現(xiàn)了一些簡化方法的研究和探討［5-10］。鑒于酸堿度對鹽酸多西環(huán)素注射液穩(wěn)定性的重要作用，并為了加快研發(fā)速度，探索簡化新方法的應用，本研究采用經(jīng)典恒溫法和單側點法進行了該注射液（pH）m預測，實驗表明，兩種方法所得結果無明顯差異。單測定法簡單易行，可與穩(wěn)定性試驗中的高溫影響因素試驗［4］同時進行，極大減少了工作量和研發(fā)成本，明顯提高了新產(chǎn)品研發(fā)的效率。

4.4 存在的問題及注意點 相對于經(jīng)典恒溫法而言，單側點法雖然使工作量顯著減少，但由于每個溫度下只有一個測試點，使精確度有所降低，其措施是增加試驗溫度數(shù)或在一個溫度下增加多批次的試驗測試，以提高精確度。

因受條件限制，本試驗僅選取60℃和80℃兩個溫度點進行恒溫經(jīng)典法和單側點法預測，下一步有待于增加試驗溫度數(shù)和批次進行復核試驗和相關探討工作。此外，溶液型制劑（pH）m的控制和調(diào)節(jié)要在考慮穩(wěn)定性的同時兼顧溶解度、生理療效等因素綜合制定。

［1］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.獸藥國家標準 獸藥地方標準上升國家標準（第九冊）［S］.

［2］農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸藥國家標準匯編-獸藥地方標準上升國家標準（第三冊）［S］.

［3］奚念朱，顧學裘.藥劑學（第二版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980：106-109.

［4］農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸藥研究技術指導原則（藥學部分）［S］.

［5］龐貽慧，魯純素.藥物穩(wěn)定性預測方法的簡化-單側點法［J］.北京醫(yī)學院學報，1983，14（3）： 271-273.

［6］龐貽慧，魯純素.藥物穩(wěn)定性預測方法的簡化-初均速法［J］.藥學學報，1983，17（3）：207-211.

［7］李友業(yè).泰樂菌素注射劑穩(wěn)定性試驗［J］.獸藥與飼料添加劑（VETERINARY PHARMACEUTICALS ＆FEED ADDITIVES），2000， 5（1）： 13-15.

［8］王 芳.初均速法預測人參莖葉皂苷的穩(wěn)定性［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2007，24（3）：217-218.

［9］王齊放，李三鳴，趙 喆，等.pH及不同緩沖鹽對阿莫西林化學穩(wěn)定性的影響［J］.沈陽藥科大學學報，1999，16（3）：176-178.

［10］毛培學，陳 葵，紀利俊，等.硫氰酸紅霉素在酸性溶液中的穩(wěn)定性研究［J］.中國抗生素雜志， 2013， 38（3）： 218-222.