重組大腸桿菌DE-pET-P46的培養(yǎng)基優(yōu)化和高密度發(fā)酵

沈青春，王 芳，張純萍，高和義，宋 立，李聰研，魏晶晶，宋蕭婷，蘇 鵬，寧宜寶?

（1.北京中海生物科技有限公司，北京100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

重組DNA技術(shù)和發(fā)酵工程的快速發(fā)展和結(jié)合，使得大量制備某種特定蛋白成為可能。大腸桿菌和酵母菌是當(dāng)前表達(dá)外源蛋白的兩種常用宿主細(xì)胞，高細(xì)胞密度發(fā)酵（high cell density cultivation，HCDC）是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，從而更多地或更高效地獲得目的產(chǎn)物的發(fā)酵技術(shù)，其在工業(yè)化上的應(yīng)用帶來的經(jīng)濟(jì)效益十分顯著［1-2］。

影響發(fā)酵過程的因素很多，包括培養(yǎng)基組成、pH、溫度、裝液量、接種量、種齡、攪拌與通氣等條件，而這些條件通常并不獨(dú)立影響發(fā)酵過程，而是存在交互作用。發(fā)酵工藝的優(yōu)化就是將影響過程的所有關(guān)鍵因素達(dá)到最佳值，從而使產(chǎn)率最大化，一般步驟包括：影響因子的確認(rèn)；確定各影響因子的影響程度并篩選因子；根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮陀绊懸蜃佑绊懗潭龋_定優(yōu)化方案進(jìn)行試驗(yàn)；對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，確定其最佳條件；最后對最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證［3-4］。

隨著統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，新的優(yōu)化方法不斷涌現(xiàn)，但總體上可分為非統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化技術(shù)兩類。非統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化技術(shù)，即傳統(tǒng)的單次單因子法（One Factor at One Time），每次只改變一個因子而其它因子保持不變，優(yōu)化方法直觀有效。統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化技術(shù)是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對多個因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，再對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到最佳配比，主要方法包括響應(yīng)面法［5-6］、最陡爬坡法［7-8］（Steepest Ascent）、進(jìn)化操作法［9］（Evolutionary Operation）、典型分析法［10］（Canonical Analysis）、Gauss-Seidel法、Nelder-Mead單純形法等，其中響應(yīng)面法是近年來應(yīng)用最多的一種優(yōu)化技術(shù)［11］。該方法是1951年Bos-Wilson研究用于化學(xué)過程因子優(yōu)化的一種綜合性方法，其基本原理是用數(shù)學(xué)模型來描述實(shí)驗(yàn)的影響因子與目標(biāo)響應(yīng)值間的關(guān)系，并以此為據(jù)，確定在目標(biāo)響應(yīng)值達(dá)到最高或最低時各因子的最佳條件。該方法能在有限實(shí)驗(yàn)次數(shù)下，確定各因子對目標(biāo)響應(yīng)值的影響，探清其交互作用的程度，最后求得其最優(yōu)化條件［12-13］。

大腸桿菌DE-pET-P46是可以高效表達(dá)豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）的 P46蛋白的重組基因工程菌。Mhp是引起豬地方流行性肺炎（Swine Enzootic Pneumoniae of Swine，EPS）的一種病原微生物，其P46蛋白是其獨(dú)有的種特異性蛋白。將P46基因親水區(qū)克隆到pET28a（+）質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌得到重組大腸桿菌DE-pET-P46，通過IPTG誘導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)重組蛋白rP46的高效表達(dá)［14］。本研究擬以重組大腸桿菌DE-pET-P46為例，主要針對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期望得到一種可以在生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)首先對各類營養(yǎng)成分進(jìn)行考察并確定哪些為影響因子，再采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定各營養(yǎng)成分的最佳配比，以實(shí)現(xiàn)當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下大腸桿菌重組菌培養(yǎng)密度的顯著提高，并初步探索使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)所能達(dá)到的菌體濃度及其對重組菌的表達(dá)是否存在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌DE-pET-P46由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要儀器 恒溫?fù)u床（上海蘇坤SYY-200B）、電子分析天平（賽多利斯 AL104）、紫外分光光度計(jì)（BENKMAN公司UV-800型）、臺式高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3K-18）、生物反應(yīng)器（NBS Bioflo410型）。

1.1.3 主要試劑 蛋白胨、酵母粉購自GIBICO公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖及無機(jī)鹽等購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌培養(yǎng)和光密度測定 將新轉(zhuǎn)化的DE3-pET-p46菌挑單菌落，接入20 mL LB（Kan+）培養(yǎng)基中37℃ 200 r／min振搖培養(yǎng)18～20 h后作為試驗(yàn)用菌種。按照0.5%的接種量將新轉(zhuǎn)化的DE3-pET-p46菌液接入3個裝有50 mL試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃ 200 r／min振蕩培養(yǎng)16 h后，取3個重復(fù)樣品，分別測定其光密度A600值或濕菌重，計(jì)算平均值。

1.2.2 培養(yǎng)基成分的確定

1.2.2.1 25%酵母浸出液和酵母粉對比試驗(yàn) 使用25%酵母浸出液替代LB培養(yǎng)基中的酵母粉成分配制培養(yǎng)基，分別按5%、10%、、15%、20%、30%的比例設(shè)立6個梯度配制培養(yǎng)基，其他成分不變，并設(shè)普通LB培養(yǎng)基作為對照，按照1.2.1的方法培養(yǎng)和測定DE-pET-P46重組菌，以確定最佳的添加濃度。

1.2.2.2 緩沖系統(tǒng)的選擇 根據(jù)25%酵母浸出液和酵母粉對比試驗(yàn)結(jié)果，將使用酵母浸出液的LB培養(yǎng)基，分別使用鉀離子磷酸鹽和鈉離子磷酸鹽以及二者搭配組成pH緩沖系統(tǒng)，按照以下配方配制培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基 1（g／L）：蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液 100 mL、葡萄糖 5.0 g、K2HPO4·3H2O 18.0 g，KH2PO43.0 g，即鉀鹽緩沖體系培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基 2（g／L）：蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液 100 mL、葡萄糖 5.0 g、Na2HPO4·12H2O 12.0 g，NaH2PO4·2H2O 2.0 g，即鈉鹽緩沖體系培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基 3（g／L）：蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液100 mL、葡萄糖 5.0 g、Na2HPO4·12H2O 16.5 g，KH2PO41.5 g，即鈉鹽緩沖體系培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基 4（g／L）：蛋白胨 10.0 g、25%酵母浸出液100 mL、葡萄糖 5.0 g、NaCl 10.0。

以上4種培養(yǎng)基分別調(diào)pH至7.2后，116℃30 min高壓滅菌，按照1.2.1的方法培養(yǎng)和檢測DE-pET-P46重組菌。

1.2.2.3 能量組分的優(yōu)化 在培養(yǎng)基1配方中，對葡萄糖的濃度進(jìn)行優(yōu)化和替換，分別加入葡萄糖、蔗糖和乳糖至終濃度5 g／L。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)16 h后測定其細(xì)胞密度A600值。

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面分析（RSA）試驗(yàn)，共有 27 個試驗(yàn)［5，11-13］。 本實(shí)驗(yàn)為了簡便起見，省去第一步直接選用蛋白胨（X1）、25%酵母浸出液（X2）、蔗糖（X3）、10×鉀離子平衡鹽（X4）4個因素為自變量，以培養(yǎng)物菌體密度為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素與水平的選取見表1。

表1 試驗(yàn)1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平取值表

對27個試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將每組實(shí)驗(yàn)吸光值A(chǔ)600的測定結(jié)果作為反應(yīng)值，使用SAS軟件對其進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到反應(yīng)值的回歸方程，通過求一階偏導(dǎo)數(shù)得到各因素的最佳值和對應(yīng)的最高反應(yīng)值。

根據(jù)試驗(yàn)1的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行二次優(yōu)化，由于25%酵母浸出液最佳添加量可能很大，不符合降低成本的要求，將其固定在10%，重新引入酵母浸出粉，考慮到蛋白胨與25%酵母浸出液的互作關(guān)系極顯著（X1?X2的P值小于0.01），新設(shè)計(jì)的試驗(yàn)包括3個因素，即蛋白胨、酵母浸出粉和蔗糖，見表2。

表2 試驗(yàn)2 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平取值表

對三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共需15個試驗(yàn)，反應(yīng)值為每組的吸光值A(chǔ)600測定結(jié)果，使用SAS軟件對其進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到反應(yīng)值的回歸方程，通過求一階偏導(dǎo)數(shù)得到各因素的最佳值和對應(yīng)的最高反應(yīng)值。

1.2.4 優(yōu)化后培養(yǎng)基的驗(yàn)證 為試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制5瓶100 mL培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)16～18 h后收獲，測定其細(xì)胞密度值A(chǔ)600和濕菌重。

1.2.5 生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)初步試驗(yàn) 按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，使用NBS Bioflo 410型生物反應(yīng)器（最大容積14 L）進(jìn)行發(fā)酵，接種量0.5%，發(fā)酵總體積8 L，反應(yīng)溫度37℃，溶氧控制20%，使用20%葡萄糖和氨水維持pH 6.4～7.6，反應(yīng)24 h加入IPTG誘導(dǎo)，32 h收獲。將收獲的菌液進(jìn)行A600測定細(xì)胞密度，算出每毫升菌體濕重。將收獲的菌體洗滌、裂解、離心提取包涵體，使用SDS-PAGE檢測，比較其與通過振搖培養(yǎng)的DE-pET-P46重組菌間是否存在差別。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分確定 以不同濃度25%酵母浸出液替代LB液體培養(yǎng)基中酵母粉，對基因重組菌培養(yǎng)效果的影響見圖1?？梢钥闯觯褂媒湍附鲆禾鎿QLB中酵母粉可明顯增加大腸桿菌的細(xì)胞濃度，隨著酵母浸出液的量增加，細(xì)胞濃度先增加后下降，最佳添加量為10%。

圖1 不同比例的25%酵母浸出液替換LB中酵母粉對大腸桿菌重組菌生長的影響

在改良的LB培養(yǎng)基中引入鉀鹽或鈉鹽緩沖系統(tǒng)，其培養(yǎng)效果如圖2?？梢钥闯?，引入磷酸鹽緩沖體系能顯著改善培養(yǎng)基的大腸桿菌培養(yǎng)濃度，其中培養(yǎng)基1（磷酸鉀鹽緩沖體系）好于磷酸鈉鹽及鉀鈉混合緩沖體系，培養(yǎng)基1、2、3均好于無緩沖體系的培養(yǎng)基4。

圖2 引入緩沖系統(tǒng)后的改良培養(yǎng)基對大腸桿菌重組菌生長的影響

在培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上，分別使用5 g蔗糖或乳糖替代葡萄糖，以比較3種糖作為碳源對重組菌培養(yǎng)密度的影響，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入3種糖對培養(yǎng)效果沒有明顯區(qū)別，但從生產(chǎn)的角度上講，蔗糖最經(jīng)濟(jì)。

圖3 使用葡萄糖、蔗糖和乳糖作為碳源的改良培養(yǎng)基對大腸桿菌重組菌生長的影響

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)的四因素三水平的響應(yīng)面分析（RSA）試驗(yàn)，共有27個試驗(yàn)的相應(yīng)值（A600）的測定結(jié)果見表3。

表3 優(yōu)化試驗(yàn)1響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過SAS的響應(yīng)面回歸（RSREG）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平。經(jīng)整理后所得的分析結(jié)果如表4。

表4 二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析

四個因素中X1、X2的P值僅為0.001，也均遠(yuǎn)小于0.01，表明 X1（蛋白胨）和 X2（25%酵母浸出液）對反應(yīng)值Y（A600）的影響極顯著；X3的P值為0.105，大于 0.05，表明 X3（蔗糖）對反應(yīng)值Y（A600）有一定的影響，但不顯著；X4的P值為0.603，表明X4（10×鉀鹽平衡鹽濃度）對反應(yīng)值 Y（A600）的影響不明顯；X1?X2的P值也僅為0.001，表明 X1（蛋白胨）和X2（25%酵母浸出液）相互間影響極顯著。

二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的P值也均遠(yuǎn)小于0.01，說明二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的擬合程度很好。

使用SAS軟件對上述試驗(yàn)結(jié)果作RSREG多元回歸分析，得出以 Y為因變量，X1、X2、X3、X4為自變量的四元二次回歸方程，對其求極值，得出Y的最大值為1.91，對應(yīng)各因素的值的位點(diǎn)分別為X1＝-0.825，X2＝1，X3＝-1，X4＝0.406，轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分即為蛋白胨 8.6 g／L、25%酵母浸出液240 mL／L、蔗糖 3.0 g／L、鉀離子平衡鹽 1.2 mL／L。由此可見25%酵母浸出液和蔗糖分別取了試驗(yàn)最高值和最低值，即這兩個因素的最佳值可能在試驗(yàn)水平范圍之外，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

根據(jù)試驗(yàn)1的結(jié)果進(jìn)行二次優(yōu)化，25%酵母浸出液添加量，重新引入酵母浸出粉。新設(shè)計(jì)的試驗(yàn)包括3個因素，即蛋白胨、酵母浸出粉和蔗糖。再次按照Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)的三因素三水平的響應(yīng)面分析（RSA）試驗(yàn)2，共有15個試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表5。

表5 優(yōu)化試驗(yàn)1響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過SAS的RSREG功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平，經(jīng)整理所得的分析結(jié)果如表6。

表6 二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析

三個因素中X1、X2的P值小于0.05，表明X1（蛋白胨）和X2（酵母浸出粉）對反應(yīng)值 Y（A600）的影響顯著；X3的P值為0.287，大于0.05，表明X3（蔗糖）對反應(yīng)值Y（A600）有一定的影響，但不顯著；X1?X3的P值小于0.05，表明X1（蛋白胨）和X3（蔗糖濃度）相互間影響顯著。

使用SAS軟件對上述試驗(yàn)結(jié)果作RSREG多元回歸分析，得出以Y為因變量，X1、X2、X3為自變量的三元二次回歸方程，對其求極值，得到Y(jié)的最大值為1.94，對應(yīng)各因素的值的位點(diǎn)分別為 X1＝0.447，X2＝0.863，X3＝0.459，轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分，即為蛋白胨蛋白胨20.1 g／L、酵母浸出粉13.2 g／L、蔗糖8.3 g／L。結(jié)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)所固定的條件和培養(yǎng)基配制的方便性，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：胨蛋白胨 20.0 g／L、酵母浸出粉13.0 g／L、25%酵母浸出液100 mL／L、蔗糖 8 g／L、K2HPO4·3H2O 10.0 g，KH2PO43.0 g。

2.3 優(yōu)化后的培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)果 按照優(yōu)化的培養(yǎng)基配方配制3瓶100 mL培養(yǎng)基，設(shè)置LB和培養(yǎng)基1作為對照，按0.5%的接種量接種DE-pET-P46重組菌，37℃振搖培養(yǎng)16～18h后收獲，測定其細(xì)胞密度值A(chǔ)600，計(jì)算濕菌重。表7結(jié)果顯示，經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基較LB培養(yǎng)基的菌體濃度高出一倍左右，培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)基本達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

表7 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)初步試驗(yàn)結(jié)果 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)DE-pET-P46重組菌菌體，培養(yǎng)24 h后，取樣測定吸光值A(chǔ)600和菌體濕重，結(jié)果分別為2.52和39.5 g／L，菌體濃度是振搖培養(yǎng)的2.7倍。

將生物反應(yīng)器培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)后收獲的DE-pET-P46重組菌菌體與普通振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)的重組菌體分別進(jìn)行洗滌、裂解后提取包涵體，使用SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖4。圖4結(jié)果表明，使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的重組大腸桿菌DE-pET-P46相比振搖培養(yǎng)，在重組蛋白rP46的表達(dá)量和包涵體占細(xì)胞總蛋白的比例上均沒有明顯的差異。

圖4 使用生物反應(yīng)器和振搖方法培養(yǎng)的DE-pET-P46重組菌SDS-PAGE電泳圖

3 討論

高密度發(fā)酵不僅可以減少培養(yǎng)體積，便于下游分離純化，還能縮短生產(chǎn)周期，提高培養(yǎng)基使用效率。通常認(rèn)為大腸桿菌菌體干重達(dá)到或超過50 g（DCW）／L即為高密度發(fā)酵。根據(jù)Riesenberg的計(jì)算結(jié)果，大腸桿菌發(fā)酵理論上能達(dá)到的最高菌體密度為 400 g（DCW／L）［15］，考慮到實(shí)際培養(yǎng)中受到各種條件限制，Markel等認(rèn)為最高的菌體密度為200 g（DCW／L），此時發(fā)酵液的 25% 充滿了長3 μm、寬1 μm的大腸桿菌，發(fā)酵液粘度很高，幾乎喪失流動性［16］。迄今為止，大腸桿菌發(fā)酵菌體密度最高的兩例報(bào)道，一例是非重組E.coli W3110的高細(xì)胞密度發(fā)酵，每升干細(xì)胞重達(dá)到174 g［16-17］；另一例是生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸的重組菌達(dá)，每升干細(xì)胞重達(dá)175.4 g［18］，但近年來沒有干重超過100 g／L的報(bào)道。

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)對培養(yǎng)基的成分和添加量進(jìn)行優(yōu)化，在國內(nèi)外已有很多的報(bào)道［15，19-20］。 本研究主要是對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，以期望實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重組大腸桿菌DE-pET-P46的高密度發(fā)酵。采用的策略是以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對幾種常用營養(yǎng)成分及pH緩沖體系進(jìn)行試驗(yàn)，然后確定關(guān)鍵的組份使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到最佳的各培養(yǎng)基組份的添加量。

在菌液中細(xì)菌濃度可通過光密度值來體現(xiàn)，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)顯示測定所使用的波長有兩種，即560 nm和600 nm，但二者間有何差別與優(yōu)勢，未能找到相關(guān)文獻(xiàn)說明。在本研究開始之前，本實(shí)驗(yàn)室對560 nm和600 nm兩種波長測定重組大腸桿菌DE-pET-P46培養(yǎng)物光密度的差異進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在所測范圍內(nèi)與濕菌重均具有很好的平行關(guān)系，但后者稍占優(yōu)，表明A600更適合于測定本株重組大腸桿菌細(xì)胞密度，以LB不同培養(yǎng)時間的吸光值和菌體重建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，基本為一條直線，R2值達(dá)99%。

本研究在對營養(yǎng)成分進(jìn)行篩選中發(fā)現(xiàn)，使用25%酵母浸出液替代酵母粉可獲得更好的菌體密度，蔗糖替代葡萄糖培養(yǎng)效果相當(dāng)，引入鉀離子pH緩沖體系對培養(yǎng)基也有一定的改善，但通過對第一輪的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，25%酵母浸出液的最佳添加量在24%以上，超過預(yù)期，可能與其干物質(zhì)太少有關(guān)。在第二輪優(yōu)化過程中，固定25%酵母浸出液的添加量，引入酵母浸出粉，以蛋白胨、酵母粉和蔗糖作為因變量，細(xì)胞密度A600為響應(yīng)量，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與計(jì)算得到最優(yōu)各因素的優(yōu)化值，轉(zhuǎn)換成培養(yǎng)基成分后得到最佳配方。通過對最優(yōu)配方進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其菌體濕重相比普通LB培養(yǎng)基有大幅度增加。使用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)條件和生產(chǎn)工藝優(yōu)化在國內(nèi)已有很多報(bào)道，盡管目標(biāo)不盡相同，但所用的方法、統(tǒng)計(jì)分析與計(jì)算基本相同［21-22］。

使用生物反應(yīng)器進(jìn)行生物發(fā)酵是現(xiàn)代生物工程的微生物生產(chǎn)工藝的典型方式。相比實(shí)驗(yàn)室的搖菌培養(yǎng)，生物反應(yīng)器可以實(shí)時控制溫度、pH、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)，并能根據(jù)需要進(jìn)行補(bǔ)料控制，使培養(yǎng)物保持在一個優(yōu)良的生長環(huán)境中，從而達(dá)到高密度發(fā)酵的目的。本文只是使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中對重組菌DE-pET-P46進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果培養(yǎng)產(chǎn)物濕菌重達(dá)到近40 g／L，這是振搖培養(yǎng)所難以達(dá)到的水平，盡管與菌體干重超過100 g／L的文獻(xiàn)報(bào)道差距甚遠(yuǎn)。為了確定高密度發(fā)酵條件下，重組菌是否還能像振搖培養(yǎng)一樣大量表達(dá)目的蛋白，通過SDS-PAGE進(jìn)行了對比檢測，結(jié)果表明二者在外源蛋白表達(dá)上沒有明顯差別。

高密度發(fā)酵技術(shù)是一個系統(tǒng)性的工程，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，其優(yōu)越性和巨大的經(jīng)濟(jì)潛力將越來越被人們重視。

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