多拉菌素澆潑劑對(duì)小鼠旋毛蟲(chóng)的療效研究

高玉紅，李曉云，石艷麗，宋銘忻*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030;2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150080)

1993 年，美國(guó)輝瑞(Pfizer)公司研發(fā)人員利用突變的阿維鏈霉菌研制合成更新一代的優(yōu)秀的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥物—多拉菌素(Doramectin)［1］。這種新研制的多拉菌素是阿維菌素的第二代產(chǎn)品，其合成的機(jī)理是在阿維菌素的第25位C上引入一環(huán)己烷基而形成的［2］，多拉菌素與阿維菌素相比其優(yōu)越性在于消除率低，血藥濃度維持的時(shí)間較長(zhǎng)，生物利用度比阿維菌素更高［1－3］。多拉菌素具有內(nèi)外兼殺的特性，對(duì)體內(nèi)線蟲(chóng)以及體外的節(jié)肢昆蟲(chóng)均具有良好的驅(qū)殺作用［4－5］。以往多拉菌素的劑型多以注射劑為主，在臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)動(dòng)物造成不同程度的刺激性［6］。我室研制出多拉菌素澆潑劑，此種劑型能夠延長(zhǎng)藥物對(duì)寄生蟲(chóng)的作用時(shí)間從而增強(qiáng)藥物的療效［7］。多拉菌素澆潑劑對(duì)家兔無(wú)任何毒性反應(yīng)，對(duì)豚鼠皮膚無(wú)刺激性反應(yīng)，不產(chǎn)生致敏作用［8］。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外先后用噻苯咪唑、甲苯咪唑等多種苯并咪唑藥物對(duì)動(dòng)物的旋毛蟲(chóng)病進(jìn)行治療試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，這類(lèi)藥物對(duì)旋毛蟲(chóng)的各個(gè)生活時(shí)期的蟲(chóng)體都有不同程度的殺滅效力。丙硫咪唑?qū)€蟲(chóng)有選擇性與不可逆性抑制其攝取葡萄糖的作用，致使蟲(chóng)體內(nèi)源性糖原耗竭，引起死亡［9］。大鼠、小鼠和豬的試驗(yàn)結(jié)果揭示，丙硫咪唑?qū)πx(chóng)成蟲(chóng)、移行幼蟲(chóng)及包囊幼蟲(chóng)均有很好的殺蟲(chóng)效果［10］。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于多拉菌素對(duì)家畜體內(nèi)外線蟲(chóng)病治療的療效報(bào)道已有很多，但對(duì)多拉菌素澆潑劑治療旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis)的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬用多拉菌素和丙硫咪唑?qū)θ斯じ腥拘x(chóng)的小鼠進(jìn)行治療，觀察其驅(qū)蟲(chóng)效果，為該藥進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用于家畜提供理論與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 多拉菌素澆潑劑，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲(chóng)室自行研制。丙硫咪唑片，上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所供。

1.1.2 動(dòng)物 35只清潔級(jí)小鼠，哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。隨機(jī)抽檢符合清潔級(jí)要求。

1.1.3 蟲(chóng)種 旋毛蟲(chóng):來(lái)自波蘭家豬體內(nèi)(編號(hào)ISS3)，小鼠中傳代。

1.1.4 主要試劑及儀器 胃蛋白酶 活力單位1∶3000，歐瑞德公司;鹽酸(含量36% ～38%，比重1.19)，歐瑞德公司;貝爾曼氏裝置東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 分組 清潔級(jí)健康昆明小白鼠35只，體重18～22 g，根據(jù)旋毛蟲(chóng)的3個(gè)發(fā)育時(shí)期和給藥的不同時(shí)間將35只小鼠隨機(jī)分為3個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組，第Ⅰ組為成蟲(chóng)組，第Ⅱ組為新生蚴組，第Ⅲ組為包囊幼蟲(chóng)組;每個(gè)試驗(yàn)組根據(jù)藥物品種將其分為2個(gè)藥物組:多拉菌素藥物組和丙硫咪唑藥物組。第Ⅳ組為陽(yáng)性對(duì)照組，以上各組每組5只，感染劑量均為200蚴/只。

1.2.2 旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的收集 取一只感染了旋毛蟲(chóng)的小鼠，斷頸處死，除去鼠皮以及內(nèi)臟器官，并且去除各種筋膜以及脂肪成分，稱(chēng)重以后放于加入適量人工消化液(人工消化液由1%胃蛋白酶加1%鹽酸組成)的搗碎機(jī)中，搗碎15 s，將搗碎機(jī)中的肉液轉(zhuǎn)入定量容器中，補(bǔ)充加入消化液至使肉液比為1∶20;在37℃的溫箱中作用3 h，期間攪拌5～10次，使其消化完全;孵育結(jié)束后使消化混合液通過(guò)60目(孔徑300 μm)網(wǎng)篩，濾液進(jìn)入小型白色瓷盆中;沉淀洗滌2～3次，每次沉淀20 min，直到濾液變?yōu)槌吻鍨橹?小心的傾去上清液，剩下100 mL左右液體注入貝爾曼氏裝置中收集旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)。

1.2.3 各組的給藥時(shí)間和劑量

1)第Ⅰ組(10只):感染劑量:200蚴/只，分為2個(gè)小組，第1小組5只，小鼠感染旋毛蟲(chóng)2 d后每只小鼠一次經(jīng)皮給藥5 mg·kg－1·bw－1多拉菌素澆潑劑，第2小組5只，小鼠感染旋毛蟲(chóng)2 d后每只每天灌胃丙硫咪唑 30 mg·kg－1·bw－1，連續(xù) 5 d。

2)第Ⅱ組(10只):感染劑量:200蚴/只，分為2個(gè)小組，第1小組5只，小鼠感染旋毛蟲(chóng)7 d后每只小鼠一次經(jīng)皮給藥5 mg·kg－1·bw－1多拉菌素澆潑劑，第2小組5只，小鼠感染旋毛蟲(chóng)7 d后每只每天灌胃丙硫咪唑 30 mg·kg－1·bw－1，連續(xù) 5 d。

3)第Ⅲ組(10只):感染劑量:200蚴/只，分為2個(gè)小組，第1小組5只，小鼠感染旋毛蟲(chóng)35 d后每只小鼠一次經(jīng)皮給藥5 mg·kg－1·bw－1多拉菌素澆潑劑，第2小組5只，每只小鼠感染旋毛蟲(chóng)35 d后每只每天灌胃丙硫咪唑30 mg·kg－1·bw－1，連續(xù)5 d。

4)第Ⅳ組(5只):感染旋毛蟲(chóng)組 小鼠感染劑量:200蚴/只。

各組小鼠于感染后50 d后一起剖殺，取膈肌壓片鏡檢，觀察多拉菌素治療組和丙硫咪唑治療組各個(gè)時(shí)期旋毛蟲(chóng)的形態(tài)變化。并用消化法計(jì)算對(duì)照組每克肌肉平均幼蟲(chóng)數(shù)(LPG)和試驗(yàn)組每克肌肉平均殘存幼蟲(chóng)數(shù)，按常規(guī)方法計(jì)算殺蟲(chóng)率。

取膈肌壓片鏡檢，觀察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)包囊及蟲(chóng)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)在藥物作用下發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。以包囊內(nèi)出現(xiàn)蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)破壞、模糊不清、蟲(chóng)體斷裂、蟲(chóng)體鈣化及蟲(chóng)體被吸收遺留空包囊和包囊變形、縮小、破損等作為判定旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在藥物作用下死亡損傷的標(biāo)志。

2 結(jié)果與分析

各組小鼠于感染后50 d后一起剖殺，取膈肌進(jìn)行壓片且鏡檢。觀察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)包囊及蟲(chóng)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)在藥物作用下發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。以包囊內(nèi)出現(xiàn)蟲(chóng)體模糊不清、結(jié)構(gòu)破壞、蟲(chóng)體鈣化、蟲(chóng)體斷裂及蟲(chóng)體被吸收遺留空包囊和包囊縮小、變形、破損等特征作為判定幼蟲(chóng)在藥物作用下死亡損傷的標(biāo)志(圖1－圖7)。

圖1 多拉菌素澆潑劑治療成蟲(chóng)

圖2 丙硫咪唑治療成蟲(chóng)

圖3 多拉菌素澆潑劑治療新生蚴

圖4 丙硫咪唑治療新生蚴

圖5 多拉菌素澆潑劑治療包囊期幼蟲(chóng)

圖6 丙硫咪唑治療包囊期幼蟲(chóng)

圖7 空白對(duì)照組

由圖可見(jiàn)，多拉菌素澆潑劑治療成蟲(chóng)組和治療新生蚴組小鼠的膈肌內(nèi)仍有存活的旋毛蟲(chóng)存在，而丙硫咪唑治療成蟲(chóng)組和治療新生蚴組小鼠的膈肌內(nèi)沒(méi)發(fā)現(xiàn)有旋毛蟲(chóng)包囊。多拉菌素澆潑劑治療包囊期幼蟲(chóng)組小鼠膈肌內(nèi)的小部分旋毛蟲(chóng)包囊結(jié)構(gòu)模糊不清，蟲(chóng)體變性，出現(xiàn)顆粒狀不透明物，鈣化成灰黑色橢圓形團(tuán)塊。丙硫咪唑治療組旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)體變性，出現(xiàn)顆粒狀且不透明物，包囊結(jié)構(gòu)模糊不清，大部分蟲(chóng)體斷裂、鈣化成灰黑色橢圓形團(tuán)塊。對(duì)照組小鼠的肌幼蟲(chóng)包囊完整透明，結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)有卷曲的旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)1～2條。

用消化法計(jì)算對(duì)照組每克肌肉平均幼蟲(chóng)數(shù)(LPG)和試驗(yàn)組每克肌肉平均殘存幼蟲(chóng)數(shù)。按常規(guī)方法計(jì)算驅(qū)蟲(chóng)率及形態(tài)學(xué)變化(表1)。

表1 多拉菌素澆潑劑和丙硫咪唑?qū)π∈笮x(chóng)不同發(fā)育期的驅(qū)蟲(chóng)效果 (n=5)

丙硫咪唑按30mg/kg連續(xù)治療5 d，對(duì)小鼠旋毛蟲(chóng)的成蟲(chóng)、移行幼蟲(chóng)和包囊幼蟲(chóng)均有100%的殺蟲(chóng)效果。多拉菌素澆潑劑按5 mg·kg－1·bw－1給藥一次，對(duì)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)期、移行幼蟲(chóng)期和包囊期幼蟲(chóng)均有治療作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多拉菌素澆潑劑對(duì)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)的殺蟲(chóng)效果最好，殺蟲(chóng)率可達(dá)99.5%，其次是旋毛蟲(chóng)的移行幼蟲(chóng)期，殺蟲(chóng)效果達(dá)96.62%，而對(duì)包囊期的幼蟲(chóng)殺蟲(chóng)效果最差，只有31.98%。在治療過(guò)程中未見(jiàn)小鼠有不良反應(yīng)。

3 結(jié)語(yǔ)

研究結(jié)果表明，多拉菌素治療小鼠旋毛蟲(chóng)的成蟲(chóng)期和新生蚴蟲(chóng)期療效顯著，對(duì)小鼠旋毛蟲(chóng)的成蟲(chóng)和新生蚴有顯著驅(qū)殺效果，而對(duì)包囊期幼蟲(chóng)效果不明顯。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因是否與包囊期幼蟲(chóng)形成包囊有關(guān)，還是可能與多拉菌素澆潑劑的劑量、劑型、給藥途徑、治療時(shí)間以及動(dòng)物品系、感染旋毛蟲(chóng)的時(shí)間長(zhǎng)短、旋毛蟲(chóng)隔離種的生物學(xué)特性等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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