鋅指E盒結(jié)合同源框2在人牙髓組織和細胞的表達*

陳麗虹 舒 珊 陳麗紅 韋 曦

轉(zhuǎn)化生長因子-β(trans-forming growth factor-β,TGF-β)為一種多肽類生長因子，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移，刺激成纖維細胞分裂。Smad是TGF-β家族信號傳導(dǎo)的下游因子，介導(dǎo)TGF-β信號由胞質(zhì)傳入胞核。鋅指E盒結(jié)合同源框2(zinc-finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)屬于ZEB家族，又稱Smad結(jié)合蛋白1(Smad-interacting protein1,SIPl)，是一類核轉(zhuǎn)錄因子[1]。ZEB2可結(jié)合TGF-β信號通路中的R-Smad，在TGF-β信號刺激下，ZEB2與R-Smad-Smad4復(fù)合體直接結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。

在一定條件下，牙髓細胞可分化為成牙本質(zhì)樣細胞，形成修復(fù)性牙本質(zhì)以保護牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體。TGF-β1在牙髓細胞和成牙本質(zhì)細胞均可合成，牙髓受到刺激或損傷時分泌進入牙髓組織的TGF-β1能夠促進牙髓細胞增殖，分泌細胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化，并已證實hDPCs的分化可由TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)，但ZEB2在人牙髓組織和細胞中的表達以及與TGF-β1的作用關(guān)系尚不明確[3]。本實驗采用FISH觀察ZEB2在牙髓組織的定位和表達，RT-qPCR和FISH檢測ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs中的表達，為進一步探討ZEB2在hDPCs成牙本質(zhì)向分化中的作用提供實驗證據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備 DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS，I型膠原酶，0.25%胰蛋白酶，0.02%乙二胺四乙酸(Gibco,澳大利亞)；青鏈霉素(Sigma，美國)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)孔板(Corning，美國)；TGF-β1(Peprotech，美國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒，SYBR Green I Master，LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)、Triton X-100、甲酰胺、無水乙醇、0.1%DEPC水、探針雜交液、DAPI染色液、熒光原位雜交探針(柏信生物有限公司)，抗熒光衰減封片劑，超微量高精度分光光度計Nanodrop ND-2000(Thermo，美國)，Axio observer Z1熒光倒置顯微鏡(Zeiss，德國),LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙髓組織切片的制備 經(jīng)患者知情同意收集中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診患者中因阻生或正畸需要拔除的健康第三磨牙(患者年齡18-25歲，無系統(tǒng)性疾病，牙周狀況良好，近兩個月內(nèi)未服用免疫制劑和抗生素)，將新鮮收集的第三磨牙劈開后置入預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中，4℃固定3d，后置入10%EDTA脫鈣液3-4個月，選擇來源于不同患者的三個牙齒進行梯度酒精脫水，石蠟包埋，制作4μm厚的石蠟切片。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測ZEB2在正常牙髓組織的定位和表達 ZEB2熒光探針按以下序列合成：5‘-TGGTGAAATGAGGGCTTGCGA-3’，3’末端標(biāo)記6-羧基熒光素(6-FAM)。牙髓組織石蠟切片脫蠟，梯度酒精復(fù)水，30%亞硫酸氫鈉液處理20min，25mg/ml蛋白酶K孵育40min，洗滌，梯度酒精脫水，風(fēng)干。探針變性，雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至組織切片。37℃雜交過夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌，梯度酒精脫水。DAPI染色，生理鹽水洗滌，風(fēng)干?？篃晒馑p封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照組按以上條件處理但不加入探針。

1.2.3 人牙髓細胞的培養(yǎng) 收集中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科18-25歲因正畸或阻生需要拔除的健康恒牙(患者均知情同意)，消毒后沿牙頸部劈開取出牙髓，去除根尖1/3根髓后，剪成1*1mm2大小的組織塊，3.3mg/mlⅠ型膠原酶37℃消化15min后離心，將組織塊鋪于培養(yǎng)瓶底，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱6-8h，待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長至70%-80%匯合，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后按1：2比例傳代。傳代細胞置于37℃常規(guī)培養(yǎng)箱，2-3d換液。

1.2.4 實時熒光定量PCR 使用DMEM培養(yǎng)基配制含TGF-β1的細胞培養(yǎng)液，濃度設(shè)定為0、2.5、5、10、20ng/ml，取生長良好的hDPCs接種至6孔板(每孔細胞數(shù)為2×105)，每組三孔，在含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，加入含不同濃度TGF-β1的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細胞生長約達到六孔板的70%-80%。RT-qPCR檢測ZEB2 mRNA的相對表達量，確定最大效應(yīng)濃度。根據(jù)上一步確定TGF-β1的最大效應(yīng)濃度為5ng/ml，實驗組以5ng/ml TGF-β1 刺激培養(yǎng) 0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，對照組不加入TGF-β1，檢測hDPCs中ZEB2 mRNA的相對表達量。Trizol試劑提取總RNA，超微量高精度分光光度計測量總RNA濃度。引物的設(shè)計及合成均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成，引物序列見表1。使用1μg體系反轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，20μl體系進行 PCR擴增。PCR擴增40個循環(huán)，包括10min預(yù)變性，95℃變性，60℃退火，72℃延伸及10min的延伸。采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

表1 本實驗所用的R T-P C R引物序列

1.2.5 FISH技術(shù)檢測ZEB2在正常和TGF-β1刺激hDPCs的定位和表達 分別取正常和5ng/ml TGF-β1培養(yǎng)24h的細胞做爬片，4%多聚甲醛(含0.1%DEPC水)固定20min，蒸餾水洗，0.5%Triton X-100通透15min，PBS洗滌，酒精脫水。分別進行探針變性，雜交緩沖液與探針混合后逐滴加入至細胞爬片，37℃雜交過夜。50%甲酰胺與2倍檸檬酸鈉緩沖液(2XSSC)洗滌，酒精脫水。DAPI染色，生理鹽水洗滌，風(fēng)干?？篃晒馑p封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照組按以上條件處理但不加入探針。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。先檢驗各樣本方差齊性，若符合方差分析條件，兩組間比較采用t-test，若不符合方差分析條件則使用秩和檢驗。使用LSD和Dunnett檢驗進行組間兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，p值小于0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 ZEB2在牙髓組織中ZEB2的定位和表達 如圖1所示，實驗組中ZEB2陽性表達主要集中于成牙本質(zhì)細胞層，呈綠色熒光，牙髓細胞中表達較弱；陰性對照組未見ZEB2陽性染色細胞。

圖1 ZEB2在正常人牙髓組織的FISH檢測(激光共聚焦顯微鏡，×200)

2.2 實時熒光定量PCR檢測ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下的表達：隨TGF-β1劑量增加，hDPCs中ZEB2 mRNA的表達逐漸上調(diào)，5ng/ml達最大(P＜ 0.05)，10-20ng/ml有下降趨勢，見表2。

表2 不同濃度TGF-β1培養(yǎng)hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

表2 不同濃度TGF-β1培養(yǎng)hDPCs 24h后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

注：與0ng/ml和20ng/ml對照組比較，*P＜0.05

濃度(ng/ml) 樣本量 ZEB2031.00±0.002.5 3 1.21±0.10532.14±0.09*10 3 1.98±0.1220 3 1.82±0.09

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示 5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h，與相同時間點對照組比較，ZEB2 mRNA表達均有上調(diào)(P＜0.05)；實驗組中隨時間增加，ZEB2 mRNA相對表達量逐漸上升，24h達峰值(P＜0.05)，隨后表達有所降低，結(jié)果見表3。

表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

表3 5ng/ml TGF-1刺激h DPCs后ZEB2m RNA的表達(×10-4)()

注：與同時間點對照組比較，*P＜0.05；與0h、72h實驗組比較，#P＜0.05

組別 樣本量ZEB2實驗組 對照組0h 3 1.00±0.01 1.00±0.002h 3 1.18±0.03* 1.03±0.056h 3 1.47±0.05* 1.06±0.1112h 3 1.90±0.04* 1.10±0.0824h 3 2.28±0.04*# 1.17±0.1048h 3 1.87±0.08* 1.14±0.0572h 3 1.72±0.12* 1.15±0.09

2.4 ZEB2在hDPCs中的定位和表達 如圖2所示，正常hDPCs的胞質(zhì)和胞核內(nèi)均可見較淺的綠色熒光，ZEB2在正常hDPCs中呈弱陽性表達，TGF-β1培養(yǎng)24h后，hDPCs中綠色熒光染色變強，胞核表達更為明顯，陰性對照組未見綠色熒光表達。

圖2 ZEB2在hDPCs的FISH檢測(激光共聚焦顯微鏡，×200)

3.討論

ZEB2/SIP1是ZEB轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，該基因序列由一個可變區(qū)域?qū)蓚€相互獨立且高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)簇連接構(gòu)成，ZEB2的鋅指結(jié)構(gòu)具有特異DNA結(jié)合活性，而可變區(qū)域中的Smad結(jié)合區(qū)域能與Smad基因的功能結(jié)構(gòu)域-MH2結(jié)構(gòu)域(Mad homology 2 domain)，結(jié)合并相互作用，參與TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細胞增殖、分化和凋亡等生物過程[4,5]。ZEB2在人外胚層來源器官包括腦、脊髓、眼、皮膚、心、肝、肺和牙胚等均有表達，Verschueren等[6]研究發(fā)現(xiàn) ZEB2可與 Smad1、Smad2、Smad3及Smad5結(jié)合并相互作用，在Smad介導(dǎo)的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮一定作用。Lucchini等[6]通過免疫組化檢測到人牙髓細胞中Smad2，Smad3和Smad4蛋白的表達，Smad蛋白是TGF-β受體作用的直接底物，TGF-β信號與細胞表面受體TGF-βRI和TGF-βRII結(jié)合，形成三聚體，激活R-Smad(Smad2和Smad3磷酸化)將信號傳導(dǎo)至胞質(zhì)，R-Smad與Co-Smad(Smad4)結(jié)合后，繼而轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白合成，使細胞表型和功能發(fā)生改變。TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路中任一環(huán)節(jié)改變均可導(dǎo)致信號傳導(dǎo)異常，影響TGF-β的細胞生物學(xué)效應(yīng)。

牙髓細胞是含有成牙本質(zhì)細胞系干細胞的特異細胞群，有一定的增殖和分化能力，較牙髓干細胞易于獲得，可作為牙髓干細胞的細胞代型進行研究[7]，但牙髓細胞的分化能力有限，因此提高牙髓細胞的成牙本質(zhì)分化能力對促進受損牙髓的修復(fù)具有積極意義。TGF-β是誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞分化和第三期牙本質(zhì)形成的主要信號分子，牙本質(zhì)基質(zhì)中存在TGF-β，成牙本質(zhì)細胞受到刺激或損傷時，可導(dǎo)致牙本質(zhì)基質(zhì)中的TGF-β釋放并作用于成牙本質(zhì)細胞，促進第三期牙本質(zhì)的形成[8，9]。TGF-β有三種異構(gòu)體，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，研究發(fā)現(xiàn)牙髓細胞主要表達TGF-β1，TGF-β1在牙髓損傷后可反應(yīng)性增加，誘導(dǎo)牙髓細胞的成牙本質(zhì)向分化[10]。Kalyva等[11]發(fā)現(xiàn)富含TGF-β1的生物材料促進修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，表明TGF-β1與成牙本質(zhì)細胞分化及牙本質(zhì)基質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Li等[12]研究顯示TGF-β1能誘導(dǎo)細胞極化和基質(zhì)沉積，致使成牙本質(zhì)樣細胞的分化和牙本質(zhì)的形成。

本實驗利用FISH檢測發(fā)現(xiàn)牙髓組織中ZEB2主要表達于成牙本質(zhì)細胞，而牙髓細胞中的表達呈較弱；FISH檢測發(fā)現(xiàn)ZEB2在正常hDPCs胞質(zhì)和胞核內(nèi)呈弱陽性表達，提示hDPCs中存在ZEB2的表達，ZEB2可能與hDPCs的成牙本質(zhì)向分化相關(guān)。Berx等[13]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中，ZEB在腫瘤早期通過抑制抑癌基因，促使細胞增殖；腫瘤后期ZEB影響細胞的極性并誘導(dǎo)其分化。RT-qPCR檢測ZEB2在不同濃度TGF-β1作用下hDPCs中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0-5ng/ml范圍內(nèi)ZEB2 mRNA的表達隨濃度增大而逐漸上調(diào)，5ng/ml達最大，10-20ng/ml有下降趨勢，說明5ng/ml是最大作用濃度，以5ng/ml TGF-β1刺激hDPCs 0-72h，與培養(yǎng)相同時間點對照組比較，ZEB2 mRNA表達均有上調(diào)；實驗組ZEB2 mRNA在TGF-β1刺激0-24h過程中表達逐漸上調(diào)，24h達到高峰，后隨時間延長表達有所降低，提示TGF-β1促進hDPCs中ZEB2的表達，TGF-β1刺激下hDPCs中ZEB2 mRNA的表達可能與TGF-β1受體、TGF-β1的細胞毒性以及其他基因和通路的相互影響有關(guān)。Shiba等[14]報道TGF-β1的作用效應(yīng)不僅與其濃度、作用時相有關(guān)，而且與細胞類型、生長狀態(tài)也有關(guān)系，TGF-β1與細胞膜上相應(yīng)的受體數(shù)量有關(guān)，當(dāng)TGF-β1與其相應(yīng)受體結(jié)合達到飽和后，即使再增加濃度也不能增強其作用；另外，也可能與不同細胞不同生長狀態(tài)分泌生長因子的效能有關(guān)，隨細胞的生長和增殖加快，細胞密度增大，細胞的分泌作用增強，外源性生長因子的作用反而不顯著。TGF-β1信號的傳導(dǎo)受到機體嚴密的調(diào)控，并與其他基因或信號通路存在交叉作用。Gregory等[15]研究發(fā)現(xiàn)在侵襲性乳腺導(dǎo)管癌中，ZEB、TGF-β與miR-200三者間可形成反饋環(huán)路，ZEB與TGF-β 的表達呈正相關(guān)，ZEB、TGF-β 與miR-200的表達呈負相關(guān)，促進腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。Burk等[16]發(fā)現(xiàn)ZEB能負性調(diào)節(jié)miR-141和miR-200c的表達，miR-141通過抑制TGF-β下調(diào)ZEB的表達，miR-200抑制ZEB轉(zhuǎn)錄因子活性，TGF-β能通過下調(diào)miR-200家族成員誘導(dǎo)ZEB蛋白的表達。本實驗TGF-β1促進ZEB2表達，這與Gregory、Burk等的研究結(jié)果相符。FISH檢測觀察到ZEB2在5ng/ml TGF-β1刺激24h后的hDPCs中表達變強，且胞核表達更為明顯，提示TGF-β1刺激可能引起ZEB2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細胞核，目前對于ZEB2在細胞中定位的研究尚不明確，已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子在胞核胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可作為一項重要的細胞調(diào)節(jié)機制[17]。以上研究提示ZEB2可能參與TGF-β1信號途徑調(diào)控牙髓細胞的成牙本質(zhì)向分化過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ZEB2在牙髓組織中主要表達于成牙本質(zhì)細胞，TGF-β1刺激hDPCs后，ZEB2的表達上調(diào)且由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，提示ZEB2可能參與TGF-β1在成牙本質(zhì)向分化的調(diào)控作用，為闡明TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)機理提供新線索，但其在細胞中的作用機制需進一步探索。

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