多孔鈦支架表面沉積牛血清白蛋白/鈣磷生物活性涂層的構(gòu)建*

朱曉晶 于 鵬 寧成云 王 焱

鈦及鈦合金具有良好機(jī)械性能、抗腐蝕性及生物型容性，目前廣泛應(yīng)用于骨組織工程及口腔種植修復(fù)領(lǐng)域。但鈦彈性模量與體骨的彈性模量不匹配，在植入人體后具有應(yīng)力屏蔽的作用，容易造成植入失敗。構(gòu)建具有多孔結(jié)構(gòu)的鈦支架能夠有效的降低鈦植入體的彈性模量，達(dá)到消除應(yīng)力屏蔽的作用[1]。受益于快速成型技術(shù)(RapidPrototyping，RP)的發(fā)展，利用選擇性激光熔覆(selective laser melting，SLM)成型技術(shù)可加工出多種具有結(jié)構(gòu)、尺寸可控的的多孔鈦支架，研究表明，在減輕應(yīng)力屏蔽的同時(shí)，多孔支架的連通孔結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)骨組織的長(zhǎng)入[2,3]。在前期工作中已對(duì)選擇性激光熔覆加工的多孔支架的力學(xué)性能和加工工藝進(jìn)行探討和分析，成功制備出孔徑結(jié)構(gòu)可控，連通性好的多孔支架[2,4]。但是由于鈦本身為生物惰性材料，需對(duì)鈦進(jìn)行表面改性處理提高其生物活性[5]。鈣磷涂層與骨的成分相近，并已被證明具有良好的生物活性[6,7]，在骨組織缺損修復(fù)中具有重要的作用，因此在多孔支架表面構(gòu)建仿生鈣磷涂層具有重要的實(shí)用價(jià)值[8]。而在人體內(nèi)骨組織的形成是在蛋白調(diào)控作用下無機(jī)礦物的沉積過程，同時(shí)蛋白質(zhì)也是骨組織的重要組成部分[9]。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過仿生法在多孔支架表面構(gòu)建含牛血清白蛋白(albumin bovine serum，BSA)的鈣磷涂層，更好的模擬人體骨的礦化,同時(shí)研究牛血清白蛋白的加入對(duì)涂層形貌、化學(xué)成分的影響,為后續(xù)多孔支架生物學(xué)性能試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 多孔支架制備 使用Magics 11(Materialise,比利時(shí))軟件設(shè)計(jì)具有連通孔的圓柱形多孔支架，支架的樑寬厚度設(shè)計(jì)為0.3mm，支架單元由八面體結(jié)構(gòu)組成。利用Dimetal-280選擇性激光熔覆設(shè)備(SLM，華南理工大學(xué))在氬氣氣氛下利用激光燒結(jié)金屬鈦粉末加工上述多孔支架。支架為圓柱形，直徑8mm，高度為8mm。工藝條件如下：鋪粉層厚60μm，激光掃描線間距為80μm，掃描速度和激光功率分別設(shè)定為700mm/s和150W。利用上述設(shè)計(jì)的工藝條件加工塊體鈦樣品，樣品加工完畢后通過線切割將樣品從基臺(tái)表面切割。將上述樣品依次在丙酮，無水乙醇、去離子水中超聲清洗20min后，經(jīng)體積比為1：1(v/v)HF和HNO3混合酸溶液酸洗，在5mol/L NaOH溶液中80℃堿處理48h。去離子水浸泡、高溫高壓滅菌。

1.2 整合BSA仿生涂層制備 模擬體液(simulated body fluid，SBF)和飽和鈣磷溶液(supersaturated calcium phosphate solution，SCP)的配制分別參照以往文獻(xiàn)所述[10,11]的方法進(jìn)行配制，所用試劑均為分析純(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。在飽和鈣磷溶液中加入適量牛血清白蛋白(MP，美國(guó))，配制成含BSA濃度為10μg/mL、的牛血清白蛋白-飽和鈣磷溶液,0.22μm濾器過濾除菌。

堿處理后的試件豎直浸入SBF溶液中,置于37℃恒溫?fù)u床。溶液每24h更換以保證離子濃度。4d后取出樣品,去離子水沖洗，37℃干燥過夜。然后將上述試件隨機(jī)分為2組，分別豎直浸入鈣磷溶液(對(duì)照組)以及上述10μg/mL牛血清白蛋白-飽和鈣磷溶液混合溶液中，于37℃恒溫?fù)u床緩慢震蕩2d。無菌去離子水沖洗，室溫下干燥，4℃密封保存?zhèn)溆谩Ｍ繉又苽溥^程在無菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.3 涂層性能表征 試件表面經(jīng)180s噴金處理，采用掃描電鏡(Zeiss EVO18，德國(guó))在10kV電壓下觀察涂層表面形貌[能譜]；使用傅里葉變換紅外光譜分析儀(Vector 33，德國(guó))分析涂層的官能團(tuán)，將多孔支架表面涂層輕輕刮下1mg加入150mg干燥的KBr粉末中研磨混勻后壓成塊體，紅外光譜的檢測(cè)范圍400-4000cm-1，分辨率4cm-1；X射線衍射分析儀(Bruker D8 ADVANCE，德國(guó))檢測(cè)與多孔支架相同工藝條件下制備的塊體樣品表面沉積的鈣磷涂層物相組成，掃描范圍范圍3°-60°，掃描速度3s/步，步長(zhǎng)0.05°。

2.結(jié)果

2.1 多孔鈦支架及涂層電鏡形貌 圖1(a)(b)顯示通過快速成型技術(shù)成功制備出多孔鈦支架，俯視圖顯示為正方形的連通孔結(jié)構(gòu)，從主視圖中可以看出多孔支架是由八面體的結(jié)構(gòu)單元組合而成的，(c)為堿處理后多孔支架表面的微觀形貌，在材料的表面成功構(gòu)建了一層均勻的納米多孔膜層。

預(yù)礦化后的多孔支架樣品浸入到SCP以及含BSA濃度為10μg/mL的SCP中礦化2d(圖2)，2組樣品表面均有均勻的礦化層生成，同時(shí)礦化層的覆蓋后的多孔支架表面更加平坦。在SCP中沉積的礦化層主要由片狀晶體組成，片狀晶片為微米級(jí)，晶體相互交錯(cuò)排列。而在含BSA濃度為10μg/mL的SCP中礦化的樣品表面的晶體則發(fā)生卷曲，晶片尺寸變小，為納米級(jí)結(jié)構(gòu)。上述兩種涂層的EDS成分分析結(jié)果如附表所示，上述兩種涂層均主要由鈣磷碳氧四種元素組成，蛋白加入后沉積獲得鈣磷涂層的鈣磷比為1.44，高于飽和鈣磷溶液中沉積涂層的鈣磷比1.39。

圖1 選擇性激光燒結(jié)加工的多孔鈦支架3D光學(xué)顯微鏡圖

圖2 預(yù)礦化的多孔支架在SCP及含有10μg/mL牛血清蛋白的SCP中沉積生成的鈣磷涂層掃描電鏡圖

2.2 X射線衍射分析 如XRD圖(圖3)所示，在含有BSA和不含BSA溶液的SCP中沉積的鈣磷涂層最顯著的差異為鈣磷涂層中的磷酸八鈣相。在SCP中沉積的涂層在2θ等于4.7°、16.1°附近存在明顯的磷酸八鈣的特征峰，而在含BSA濃度為10μg/mL的SCP中則不存在磷酸八鈣的晶相結(jié)構(gòu)。XRD結(jié)果還表明，兩種涂層都主要由羥基磷灰石晶相組成，其特征峰位于2θ等于26.1°、28.2°、32.2°、34.1°、49.7°等附近。通過對(duì)XRD峰強(qiáng)度的比較分析，還可以得出蛋白加入SCP后沉積的鈣磷涂層的結(jié)晶度要明顯低于不加入蛋白的SCP中沉積的涂層。

圖3 多孔支架表面沉積鈣磷涂層的XRD圖譜

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析 傅里葉紅外光譜(圖4)中顯示出多孔支架表面的鈣磷涂層含有羥基磷灰石中磷酸根的特征峰，兩組涂層在1025cm-1，963cm-1，604cm-1，560cm-1附近均出現(xiàn)的P-O特征峰。另外兩者譜圖中均在872，1422cm-1附近出現(xiàn)CO32-的特征峰，結(jié)合XRD圖譜中羥基磷灰石峰的存在表明涂層中含有碳酸化的羥基磷灰石。此外，含BSA的SCP中沉積的涂層的紅外圖譜中還在911cm-1和1108cm-1處存在的特征峰P-OH，為磷酸八鈣晶相的特征峰。另外，在含BSA的SCP中沉積的鈣磷涂層中出現(xiàn)了BSA的特征峰酰胺Ⅰ帶振動(dòng)峰(1654cm-1)和酰胺Ⅱ帶振動(dòng)峰(1541cm-1)。

附表 SCP及含BSA濃度為10μg/m L的SCP中沉積的鈣磷涂層的能譜成分分析

圖4 多孔支架表面涂層FTIR圖譜(a)SCP及(b)含BSA濃度為10μg/mL的SCP中沉積的鈣磷涂層

3.討論

選擇性激光熔覆技術(shù)是利用粉末材料(金屬或非金屬)在激光照射下燒結(jié)的原理，在計(jì)算機(jī)控制下層層堆積成型。根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(computer aided design，CAD)生成的三維實(shí)體模型通過分層軟件分層獲得二維數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)控制激光束，有選擇性地對(duì)鋪好鈦粉進(jìn)行燒結(jié)，加工出要求形狀的薄層，逐層累積形成實(shí)體模型。具有制作工藝簡(jiǎn)單、精度高的特點(diǎn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于種植體、支架等的制造。本實(shí)驗(yàn)利用優(yōu)化的工藝參數(shù)，通過選擇性激光熔覆技術(shù)成功加工出尺寸可控的多孔支架，獲得的多孔鈦支架具有良好的連通孔結(jié)構(gòu)，并且保持了設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)，具有良好的重復(fù)性。

Marco A等通過仿生沉積的方法成功地在多孔支架的表面沉積鈣磷涂層[12]。研究表明鈣磷涂層具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性，是良好的無機(jī)涂層[13,14]。鈣磷涂層的仿生法制備不受形狀限制，可以在任意形狀支架、種植體表面沉積鈣磷涂層，而且該法是在低溫下進(jìn)行，為蛋白等生物活性分子的加入提供了可能。為了提高種植體表面生物活性，在種植體表面構(gòu)建有機(jī)-無機(jī)復(fù)合涂層是目前骨組織缺損修復(fù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)在SCP中加入BSA，期望構(gòu)建出BSA/鈣磷復(fù)合涂層。利用酸堿處理技術(shù)活化多孔鈦支架表面，形成一層利于磷灰石沉積的微納米多孔膜層，在模擬體液中，鈣磷可以快速在微納米多孔膜層的表面沉積，獲得預(yù)礦化膜層，為后續(xù)的鈣磷溶液中的鈣磷涂層的成長(zhǎng)提供形核位點(diǎn)[15-17]。

結(jié)果證明，通過仿生法可成功將BSA整合到鈣磷涂層的內(nèi)部。掃描電鏡結(jié)果顯示，鈣磷涂層在多孔支架表面實(shí)現(xiàn)了均勻沉積，且SCP中BSA的加入改變了鈣磷涂層的形貌，涂層由無蛋白時(shí)的片狀晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)轵榍募{米級(jí)結(jié)構(gòu)。羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)會(huì)影響成骨細(xì)胞黏附、增值、分化行為[18]。另外，從能譜元素鈣磷比分析，XRD及FTIR結(jié)果可知，BSA在改變涂層形貌的同時(shí)也對(duì)涂層的晶相結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，蛋白的整合減少了晶體中磷酸八鈣相的含量，同時(shí)降低了晶體的結(jié)晶度。這一方面是由于在鈣磷涂層的沉積過程中蛋白質(zhì)吸附于礦化層的沉積界面改變了該處的界面能，從而不利于磷酸八鈣相的沉積[19]。此外由于蛋白整合到了部分磷灰石晶體的晶格內(nèi)部，改變了磷灰石晶體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致涂層的結(jié)晶度下降。羥基磷灰石結(jié)晶度降低，降解速度加快，鈣磷離子析出，鈣磷離子活性基團(tuán)可以在種植體表面形成活性層面，利于蛋白吸附，促進(jìn)成骨細(xì)胞在種植體表面的粘附[20]。

綜上所述，本研究在利用快速成型技術(shù)制備的多孔鈦支架的表面成功沉積了具有BSA整合的鈣磷復(fù)合涂層，BSA的整合改變了鈣磷涂層的形貌、化學(xué)成分。上述理化性能的改變對(duì)多孔支架表面膜層生物學(xué)能的影響尚待進(jìn)一步研究。

[1]Van Bael S,Chai Y C,Truscello S,et al.The effect of pore geometry on the in vitro biological behavior of human periosteum-derived cells seeded on selective laser-melted Ti6Al4V bone scaffolds[J].Acta Biomaterialia,2012,8(7):2824-2834

[2]Sun J F,Yang Y Q,Wang D.Mechanical properties of a Ti6Al4V porous structure produced by selective laser melting[J].Materials&Design,2013,49:545-552

[3]Li J P,Habibovic P,Yuan H P,et al.Biological performance in goats of a porous titanium alloy-biphasic calcium phosphate composite[J].Biomaterials,2007,28(29):4209-4218

[4]Su X B,Yang Y Q,Yu P,et al.Development of porous medical implant scaffolds via laser additive manufacturing[J].Transactions Of Nonferrous Metals Society Of China,2012,221:S181-S187

[5]徐 娟，胡 敏.鈦合金表面改性與骨結(jié)合能力的研究進(jìn)展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013，11(2):119-122

[6]Peng F,Shaw M T,Olson J R,et al.Influence of surface treatment and biomimetic hydroxyapatite coating on the mechanical properties of hydroxyapatite/poly(L-lactic acid)fibers[J].Journal of Biomaterials Applications,2012，

[7]Ballo A M,Xia W,Palmquist A,et al.Bone tissue reactions to biomimetic ion-substituted apatite surfaces on titanium implants[J].Journal of The Royal Society Interface,2012,9(72):1615-1624

[8]Chai Y C,Kerckhofs G,Roberts S J,et al.Ectopic bone formation by 3D porous calcium phosphate-Ti6Al4V hybrids produced by perfusion electrodeposition[J].Biomaterials,2012,33(16):4044-4058

[9]Bleek K,Taubert A.New developments in polymer-controlled,bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueoussolution[J].Acta Biomaterialia,2013,9(5):6283-6321

[10]Kokubo T.Apatite formation on surfaces of ceramics,metals and polymers in body environment[J].Acta Materialia,1998,46(7):2519-2527

[11]Liu Y,Layrolle P,de Bruijn J,et al.Biomimetic coprecipitation of calcium phosphate and bovine serum albumin on titanium alloy[J].Journal of biomedical materials research,2001,57(3):327-335

[12]Lopez-Heredia M A,Sohier J,Gaillard C,et al.Rapid prototyped porous titanium coated with calcium phosphate as a scaffold for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2008,29(17):2608-2615

[13]Bae S E,Choi J,Joung Y K,et al.Controlled release of bone morphogenetic protein(BMP)-2 from nanocomplex incorporated on hydroxyapatite-formed titanium surface[J].Journal of Controlled Release,2012，

[14]Lee J A,Lee W.Calcium phosphate-mediated surface modification of titanium oxide and its effects on surface potential and fibrinogen adsorption[J].Journal of Industrial and Engineering Chemistry,2013,19(5):1448-1456

[15]Uchida M,Kim H M,Kokubo T,et al.Effect of water treatment on the apatite-forming ability of NaOH-treated titanium metal[J].Journal of Biomedical Materials Research,2002,63(5):522-530

[16]何福明，劉 麗，趙士芳，等.多孔純鈦種植體表面快速沉積鈣磷涂層的研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2007,24(4):806-811

[17]Pattanayak D K,Yamaguchi S,Matsushita T,et al.Effect of heat treatments on apatite-forming ability of NaOH-and HCl-treated titanium metal[J].Journal Of Materials Science-Materials In Medicine,2011,22(2):273-278

[18]Chou Y F,Huang W,Dunn J C,et al.The effect of biomimetic apatite structure on osteoblast viability,proliferation,and gene expression[J].Biomaterials,2005,26(3):285-295

[19]Wang K F,Leng Y,Lu X,et al.Theoretical analysis of protein effects on calcium phosphate precipitation in simulated body fluid[J].Crystengcomm,2012,14(18):5870-5878

[20]Narayanan R,Seshadri S K,Kwon T Y,et al.Calcium phosphate-based coatings on titanium and its alloys[J].Journal of Biomedical Materials Research Part B,2008,85(1):279-299