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    一株巨大芽孢桿菌J1的生胞培養(yǎng)及優(yōu)化

    2014-11-22 13:55司云龍等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:氮源碳源培養(yǎng)基

    司云龍等

    摘要:以巨大芽孢桿菌J1為材料,利用溶磷圈法測定了菌株的解磷能力,優(yōu)化了菌株的最佳發(fā)酵條件、最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明,此菌株溶磷效果明顯;此菌株生長的最適培養(yǎng)時間為 28 h,最適接種量為6.7%,最適pH值為8.5;最佳碳源為玉米粉與葡萄糖的復(fù)合碳源,最佳氮源為大豆粉與硫酸銨的復(fù)合氮源。搖瓶培養(yǎng)的接種量為6.7%,pH值為8.5,250 mL 三角瓶中最適裝液體積為 30 mL,培養(yǎng)溫度為30 ℃,培養(yǎng)時間為28 h,最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為:玉米粉20 g/L,葡萄糖5 g/L,大豆粉7.5 g/L,硫酸銨 0.33 g/L,各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為:硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。

    關(guān)鍵詞:巨大芽孢桿菌;培養(yǎng)基;芽孢率;氮源;碳源;培養(yǎng)條件

    中圖分類號: S144.9文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)10-0359-03

    收稿日期:2013-12-11

    基金項目:國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(編號:201210449130)。

    作者簡介:司云龍(1990—),男,從事微生物肥料研究。E-mail:xiaosiwuqing@163.com。

    通信作者:任麗麗,講師,從事微生物肥料研究。E-mail:tutuya_001g@163.com。植物生長發(fā)育過程中,磷元素以多種方式參與生物體內(nèi)的代謝過程,是植物不可缺少的大量元素之一[1-2]。土壤中的磷元素主要以難溶磷酸鹽的形式存在,可溶性磷含量很少。據(jù)統(tǒng)計,世界土壤的平均含磷量約為0.04%,我國土壤的平均含磷量為0.02%~0.1%,南方酸性土壤含磷量低于0.04%[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),土壤中存在解磷微生物,它們能夠?qū)⒘姿猁}轉(zhuǎn)化為可溶性磷供植物吸收利用,解磷菌還可以產(chǎn)生有機酸、生長素、抗生素等物質(zhì),刺激作物生長,抑制病原菌生長,改善土壤微環(huán)境,從而更有利于植物生長發(fā)育[5-9]。目前對磷細菌的研究僅局限于菌種分離選育及作用效果比較方面,對于影響磷細菌生長的因素研究較少[10-13]。微生物種類多樣,發(fā)酵過程中受各種因素的影響,導(dǎo)致菌株發(fā)酵水平相對較低[14]。本試驗探討環(huán)境因素對巨大芽孢桿菌生長的影響,并在此基礎(chǔ)上探討該菌的最佳發(fā)酵條件,旨在為擴大巨大芽孢桿菌生產(chǎn)規(guī)模提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    巨大芽孢桿菌J1由山東京博控股股份有限公司技術(shù)中心生物化工研究所提供。

    1.2培養(yǎng)基

    搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基:玉米粉 30 g,大豆粉15 g,K2HPO4 2.0 g,MgSO4 2.0 g,CaCO3 1.5 g,MnSO4 0.05 g,H2O 1 000 mL,pH 值為7。平板培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉 5.0 g,牛肉膏粉 3.0 g,瓊脂15 g,H2O 1 000 mL。蛋黃培養(yǎng)基:將50%的蛋黃液按照6%的比例加入平板培養(yǎng)基中。

    1.3方法

    1.3.1巨大芽孢桿菌J1解磷效能測定 根據(jù)巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養(yǎng)基上形成的透明圈直徑判斷其解磷效能。

    1.3.2培養(yǎng)條件對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    1.3.2.1pH值對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng),分別于pH 值為5.5、6.5、7.5、8.5情況下180 r/min、30 ℃ 振蕩培養(yǎng)28 h 后進行平板計數(shù)。

    1.3.2.2培養(yǎng)時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng),在pH值為8.5、轉(zhuǎn)速為175 r/min、30 ℃ 下分別振蕩培養(yǎng)24、28、32、36 h后進行計數(shù)。

    1.3.2.3接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響采用搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在 pH值為8.5、轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下將接種量分別為 3.3%、6.7%、10.0%的搖瓶置于振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃ 培養(yǎng)28 h 后進行計數(shù)。

    1.3.3最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化按照設(shè)計方案,配制不同的培養(yǎng)基,250 mL三角瓶中每瓶裝量30 mL,原始pH 值為8.5,接種量為6.7%,180 r/min培養(yǎng)28 h后平板計數(shù),采用正交試驗法找出最適培養(yǎng)基及最佳碳源、氮源。

    2結(jié)果與分析

    2.1巨大芽孢桿菌J1解磷能力的測定

    由圖1可知,巨大芽孢桿菌J1在蛋黃培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d可產(chǎn)生明顯的溶磷圈,溶磷圈直徑與菌落直徑比值高達4.1,初步判斷巨大芽孢桿菌有解磷能力。

    2.2pH值對巨大芽孢桿菌J1菌株生長的影響

    由圖2可知,巨大芽孢桿菌J1在各pH值下長勢良好,在pH值為 8.5條件下生長最好,活菌數(shù)達35×107 CFU/mL。

    2.3培養(yǎng)時間對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    由圖3可知,培養(yǎng)28 h 菌株生長最好,活菌數(shù)為 35×107 CFU/mL,芽孢率為84%,到達某一時間拐點后繼續(xù)培養(yǎng),菌體會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

    2.4接種量對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    接種量對菌體生長有影響,所以接種量要適度,接種量過低會導(dǎo)致延滯期過長,菌體量不高;接種量過高,帶入培養(yǎng)基內(nèi)的代謝產(chǎn)物過多,反而不利于菌體生長。由圖4可知,當接種量為 6.7% 時,菌株生長最好,活菌數(shù)為36×107 CFU/mL,芽孢率為86% 。

    2.5碳源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    分別用30 g/L玉米粉、10 g/L葡萄糖、復(fù)合碳源(玉米粉、葡萄糖各減半混合在一起)配制碳源培養(yǎng)基,其他成分同搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基。接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件,測定活菌總數(shù)及芽孢數(shù),結(jié)果表明,采用玉米粉與葡萄糖的復(fù)合碳源作為培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高,活菌數(shù)達到36×107 CFU/mL,芽孢數(shù)達到35×107 CFU/mL(圖5)。

    2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    以玉米粉為碳源,在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下,分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源(大豆粉、硫酸銨各減半)配制氮源培養(yǎng)基,接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件,測定活菌數(shù)及芽孢數(shù),結(jié)果表明,采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL,芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL,芽孢率達9591%(圖6)。

    2.7正交試驗結(jié)果

    以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源,以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源,結(jié)果表明,最佳組合為玉米粉20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,大

    3結(jié)論與討論

    巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力,在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g,大豆粉15 g,磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸鎂2.0 g,碳酸鈣1.5 g,硫酸錳5.0 g,蒸餾水1 000 mL,轉(zhuǎn)速為180 r/min,溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL;最適培養(yǎng)時間為28 h,活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL,芽孢率為84%;最適接種量為6.7%,活菌數(shù)達36×107 CFU/mL,芽孢率為86%。本研究表明,培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%,pH值為85,250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL,培養(yǎng)溫度為 30 ℃,培養(yǎng)時間為28 h,最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為:玉米粉 20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,黃豆粉7.5 g/L,硫酸銨0.33 g/L,各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為:硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程,受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明,巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低,所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

    參考文獻:

    [1]Wallander H. Uptake of P from apatite by Pinus sylvestris seedlings colonised by different ectomycorrhizal fungi[J]. Plant and Soil,2000,218(1/2):249-256.

    [2]龐欣,李春儉,張福鎖. 缺磷脅迫對黃瓜體內(nèi)磷運輸及再分配的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,1999,5(2):42-48.

    [3]蔣柏藩. 根據(jù)作物、土壤和磷礦條件來看我國磷肥發(fā)展的前景[J]. 土壤,1982,14(4):121-127.

    [4]孫波,張?zhí)伊?,趙其國. 南方紅壤丘陵區(qū)土壤養(yǎng)分貧瘠化的綜合評價[J]. 土壤,1995(3):119-128.

    [5]梁錦鋒. 解磷細菌(Bacillus megaterium var. phosphaticum)生長條件及解磷機理的研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2001.

    [6]臧威,孫劍秋,王鵬,等. 東北地區(qū)四種農(nóng)作物根際磷細菌的分布[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,17(6):1206-1210.

    [7]林寶英,譚志瓊,張容意. 枯草芽孢桿菌B25抗菌物質(zhì)初步研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(1):82-84.

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    [10]李福后,王偉霞,潘建梅. 有機磷分解細菌的選育及其發(fā)酵條件的研究[J]. 中國土壤與肥料,2007(6):74-77.

    [11]陳凱,李紀順,楊合同,等. 巨大芽孢桿菌P1的解磷效果與發(fā)酵條件研究[J]. 中國土壤與肥料,2010(4):73-76.

    [12]葉云峰,黎起秦,袁高慶,等. 枯草芽孢桿菌B47菌株高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報,2011,38(9):1339-1346.

    [13]郭夏麗,狄源寧,王巖. 枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J]. 中國土壤與肥料,2012(3):99-103.

    [14]梁錦鋒,陳欣,唐建軍. 1株磷細菌基本培養(yǎng)條件的研究[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報,2002,19(4):8-11.

    [15]張文芝,郭堅華. 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(6):114-117.

    2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    以玉米粉為碳源,在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下,分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源(大豆粉、硫酸銨各減半)配制氮源培養(yǎng)基,接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件,測定活菌數(shù)及芽孢數(shù),結(jié)果表明,采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL,芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL,芽孢率達9591%(圖6)。

    2.7正交試驗結(jié)果

    以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源,以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源,結(jié)果表明,最佳組合為玉米粉20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,大

    3結(jié)論與討論

    巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力,在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g,大豆粉15 g,磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸鎂2.0 g,碳酸鈣1.5 g,硫酸錳5.0 g,蒸餾水1 000 mL,轉(zhuǎn)速為180 r/min,溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL;最適培養(yǎng)時間為28 h,活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL,芽孢率為84%;最適接種量為6.7%,活菌數(shù)達36×107 CFU/mL,芽孢率為86%。本研究表明,培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%,pH值為85,250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL,培養(yǎng)溫度為 30 ℃,培養(yǎng)時間為28 h,最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為:玉米粉 20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,黃豆粉7.5 g/L,硫酸銨0.33 g/L,各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為:硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程,受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明,巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低,所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

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    2.6氮源對巨大芽孢桿菌J1生長的影響

    以玉米粉為碳源,在搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下,分別以15.0 g/L大豆粉、0.67 g/L硫酸銨、復(fù)合氮源(大豆粉、硫酸銨各減半)配制氮源培養(yǎng)基,接種后按照上述最佳培養(yǎng)條件,測定活菌數(shù)及芽孢數(shù),結(jié)果表明,采用復(fù)合氮源培養(yǎng)基獲得的活菌數(shù)、芽孢數(shù)較高,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL,芽孢數(shù)達33×107 CFU/mL,芽孢率達9591%(圖6)。

    2.7正交試驗結(jié)果

    以玉米粉與葡萄糖混合物作為碳源,以大豆粉、硫酸銨混合物作為氮源,結(jié)果表明,最佳組合為玉米粉20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,大

    3結(jié)論與討論

    巨大芽孢桿菌J1具有較強的解磷能力,在蛋黃培養(yǎng)基上解磷圈明顯。在培養(yǎng)基配方為玉米粉30 g,大豆粉15 g,磷酸氫二鉀2.0 g,硫酸鎂2.0 g,碳酸鈣1.5 g,硫酸錳5.0 g,蒸餾水1 000 mL,轉(zhuǎn)速為180 r/min,溫度為30 ℃ 的培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌的最適pH值為8.5,活菌數(shù)達 35×107 CFU/mL;最適培養(yǎng)時間為28 h,活菌數(shù)達到35×107 CFU/mL,芽孢率為84%;最適接種量為6.7%,活菌數(shù)達36×107 CFU/mL,芽孢率為86%。本研究表明,培養(yǎng)基成分是影響芽孢形成的重要因素。巨大芽孢桿菌對于碳源、氮源及 Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等離子反應(yīng)較敏感[15]。培養(yǎng)基配方不同直接導(dǎo)致發(fā)酵菌數(shù)存在巨大差異。搖瓶培養(yǎng)的接種量為67%,pH值為85,250 mL三角瓶中最適裝液體積為 30 mL,培養(yǎng)溫度為 30 ℃,培養(yǎng)時間為28 h,最適宜轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖瓶培養(yǎng)條件下,巨大芽孢桿菌活菌數(shù)各影響因素最佳組合為:玉米粉 20 g/L,葡萄糖5.0 g/L,黃豆粉7.5 g/L,硫酸銨0.33 g/L,各因子對巨大芽孢桿菌活菌數(shù)的影響由大到小依次為:硫酸銨濃度>玉米粉濃度>葡萄糖濃度>大豆粉濃度。 芽孢的形成是一個極其復(fù)雜的過程,受形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等多方面因素的影響。巨大芽孢桿菌培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于獲得較高活菌數(shù)的同時提高芽孢轉(zhuǎn)化率。本研究表明,巨大芽孢桿菌J1營養(yǎng)要求比較低,所需原料來源廣、成本低、芽孢率較高。本試驗獲得的最佳培養(yǎng)條件可以進一步應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

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