ERIC—PCR指紋圖譜及電鏡技術在納豆生產(chǎn)菌鑒定中的應用

宋凱凱等

摘要：納豆是一種傳統(tǒng)的日本食品，由納豆菌在一定溫度濕度條件下發(fā)酵大豆而來，新鮮納豆表面金黃色，風味獨特營養(yǎng)豐富。納豆的主要發(fā)酵菌為納豆菌，屬芽孢桿菌屬，稱為納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis var. natto），是好氧的革蘭氏陽性菌。利用掃描電子顯微鏡和ERIC-PCR指紋圖譜技術對4株納豆菌（高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭）進行了親緣關系鑒定。結果顯示，MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近，而高橋納豆與其他品種親緣關系較遠。

關鍵詞：納豆菌；形態(tài)學；ERIC-PCR；聚類分析；電鏡

中圖分類號： Q934；Q933文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0300-03

收稿日期：2013-12-12

基金項目：山東省科學技術廳省良種工程項目（編號：2011LZ006）。

作者簡介：宋凱凱（1988—），女，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事食藥用菌分子遺傳育種。E-mail：skk1003@126.com。

通信作者：郭立忠，教授，主要從事食藥用菌的品種改良。E-mail：glz119@126.com。納豆（natto）是日本傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品。納豆的主要發(fā)酵菌為納豆菌，屬芽孢桿菌屬，是好氧的革蘭氏陽性菌[1]。納豆菌能分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)，使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分，還能分泌各種酶和維生素，從而可促進小腸黏膜細胞的增殖，保證小腸功能正常[2-6]。納豆還能有效預防和輔助治療心腦血管疾病。納豆防治心腦血管疾病的藥用價值主要源自納豆激酶[7]。自1987年納豆中發(fā)現(xiàn)強力溶栓激酶——納豆激酶以來，納豆引起了全世界的廣泛關注[8]。該酶不僅有顯著的溶栓作用，還可以激活靜脈內(nèi)皮細胞的纖維蛋白酶原[9-10]。此外，納豆菌發(fā)酵液中含有多達17種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸[11]，因此納豆具有“超級健康食品”的美譽。然而，由于當今市場納豆產(chǎn)品種類繁多，都有各自的菌種命名，因此本試驗利用掃描電子顯微鏡和ERIC-PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR）指紋圖譜技術[12]對4個納豆菌生產(chǎn)種進行鑒定分析，旨在鑒定其個體形態(tài)的差別及親緣關系的遠近。

1材料與方法

1.1供試菌株

4個納豆菌株（高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM 無臭），由青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)應用真菌研究室提供。

1.2方法

1.2.1單菌落培養(yǎng) 將4種納豆菌株接種到LB液體培養(yǎng)基（成分為 10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl）中，放入搖床37 ℃、180 r/min條件下過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋100倍后取50 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基（成分為10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl、20 g/L瓊脂）上，放入 37 ℃ 恒溫箱中過夜培養(yǎng)，分別挑取菌落做四區(qū)劃線放入 37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)5 h，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

1.2.2菌種的形態(tài)學分析——制作納豆菌的電鏡樣品（1）將浸泡在75%乙醇中的潔凈蓋玻片取出在酒精燈火焰上燒一下，待蓋玻片冷卻后將其放到平板培養(yǎng)的菌落上輕壓一下粘取菌落；然后用PBS（pH值為7.4，將2.9 g NaH2PO4·2H2O與29 g Na2HPO4·12H2O用去離子水定容到500 mL）處理3次，每次10 min；用戊二醛固定液（配制比例為戊二醛 ∶PBS ∶去離子水體積比1 ∶8 ∶1）固定2 d，中間換1次固定液。（2）固定2 d后用PBS洗3次，每次10 min。（3）分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇洗樣品1 h，使其逐步脫水，再用100%乙醇洗樣品30 min。（4）用乙醇 ∶叔丁醇=1 ∶1 的混合液洗樣品30 min，再用100%叔丁醇洗樣品2次，每次30 min，用叔丁醇逐漸將乙醇從樣本中替換出來。（5）將樣本抽真空，把蓋玻片壓碎，將有菌的碎片用導電膠粘附到觀察臺上噴涂導電材料，然后在電子顯微鏡下觀察。

1.2.3細菌基因組DNA的提?。–TAB/NaCl法）（1）將活化好的菌株轉接到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至飽和狀態(tài)，取1.5 mL培養(yǎng)物10 000 r/min離心3 min。（2）沉淀物加入600 μL的TE緩沖液，用吸管反復吹打使之重懸，加入少量溶菌酶，37 ℃溫浴30 min，加入30 μL 10%的SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，混勻，于37 ℃溫浴1 h。（3）加入 100 μL 5 mol/L的NaCl，充分混勻，再加入80 μL CTAB/NaCl溶液，混勻，于65 ℃溫浴15 min。（4）加入等體積的三氯甲烷、異戊醇，混勻，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉到一個新管中，如果難以移出上請，先用牙簽去除界面物質(zhì)。（5）加入等體積的酚、三氯甲烷、異戊醇，混勻，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉入另一支新管中。（6）加入1倍體積無水乙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，放入-20 ℃冰箱沉淀 30 min，取出后12 000 r/min離心10 min，將沉淀轉移到 1 mL 70%乙醇中洗滌。（7）12 000 r/min離心15 min，棄上清，用超凈工作臺稍加干燥，重溶于50 μL的TE緩沖液。（8）取 2 μL 上述提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4基因組DNA純度檢測用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，如果DNA條帶清晰、整齊、明亮且無拖尾，則表明DNA完整性好且純度較高，可用作PCR反應。

1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35個循環(huán)；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 結束擴增。

2結果與分析

2.1形態(tài)學分析

由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出，MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀，而高橋納豆的菌體呈長桿狀，因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近，而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

2.2DNA提取結果

4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5，圖中1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn)， DNA條帶

清晰、整齊、明亮且無拖尾，表明DNA完整性好且純度較高，可用作PCR反應。

2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中M泳道為marker，1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析，結果見圖7。

由圖7可知，當以相似性系數(shù)0.64為閾值時，4個菌株聚成2組：第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1， 第2

組為高橋納豆；當以相似性系數(shù)0.75為閾值時，4個菌株聚成3組，MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組，MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

3討論

本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術，最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近，而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論，同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

參考文獻：

[1]鐘青萍，余世望，梁勝媛. 納豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā)，2001，22（4）：16-18.

[2]陳麗花，陳有容，齊鳳蘭. 功能性食品——納豆的研制[J]. 上海水產(chǎn)大學學報，2001，10（2）：187-189.

[3]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

[4]Esaki H.，Onozaki H.，Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser，1994，546：353-360.

[5]鐘青萍，石木標，王斌. 多功能保健食品——納豆[J]. 食品研究與開發(fā)，2003，24（4）：81-83.

[6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry，1997，14：47.

[7]奚曉琦，王加啟，卜登攀，等. 納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40（11）：69-75.

[8]蔣立文，周傳云，黃香華. 納豆菌的研究現(xiàn)狀和應用進展[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2007（6）：24-26.

[9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku，1993，126（6）：299-303.

[10]平谷一，中西晃一朗，須見洋行. 血栓溶解劑：日本，日本公開特許89180834[P]. 1989-05-20.

[11]陳有容，齊鳳蘭，陳麗花.納豆芽孢桿菌發(fā)酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工業(yè)，2003（4）：42-44.

[12]張輝，楊振泉，趙雋，等. 大腸桿菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（5）：1098-1103.

1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35個循環(huán)；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 結束擴增。

2結果與分析

2.1形態(tài)學分析

由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出，MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀，而高橋納豆的菌體呈長桿狀，因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近，而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

2.2DNA提取結果

4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5，圖中1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn)， DNA條帶

清晰、整齊、明亮且無拖尾，表明DNA完整性好且純度較高，可用作PCR反應。

2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中M泳道為marker，1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析，結果見圖7。

由圖7可知，當以相似性系數(shù)0.64為閾值時，4個菌株聚成2組：第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1， 第2

組為高橋納豆；當以相似性系數(shù)0.75為閾值時，4個菌株聚成3組，MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組，MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

3討論

本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術，最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近，而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論，同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

參考文獻：

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1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35個循環(huán)；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 結束擴增。

2結果與分析

2.1形態(tài)學分析

由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出，MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀，而高橋納豆的菌體呈長桿狀，因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近，而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

2.2DNA提取結果

4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5，圖中1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn)， DNA條帶

清晰、整齊、明亮且無拖尾，表明DNA完整性好且純度較高，可用作PCR反應。

2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中M泳道為marker，1～4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析，結果見圖7。

由圖7可知，當以相似性系數(shù)0.64為閾值時，4個菌株聚成2組：第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1， 第2

組為高橋納豆；當以相似性系數(shù)0.75為閾值時，4個菌株聚成3組，MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組，MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

3討論

本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術，最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近，而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論，同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

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[5]鐘青萍，石木標，王斌. 多功能保健食品——納豆[J]. 食品研究與開發(fā)，2003，24（4）：81-83.

[6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry，1997，14：47.

[7]奚曉琦，王加啟，卜登攀，等. 納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40（11）：69-75.

[8]蔣立文，周傳云，黃香華. 納豆菌的研究現(xiàn)狀和應用進展[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2007（6）：24-26.

[9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku，1993，126（6）：299-303.

[10]平谷一，中西晃一朗，須見洋行. 血栓溶解劑：日本，日本公開特許89180834[P]. 1989-05-20.

[11]陳有容，齊鳳蘭，陳麗花.納豆芽孢桿菌發(fā)酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工業(yè)，2003（4）：42-44.

[12]張輝，楊振泉，趙雋，等. 大腸桿菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（5）：1098-1103.