核桃葉部?jī)?nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性及GC—MS分析

李麗等

摘要：以核桃葉部分離獲得的20株內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種常見(jiàn)植物病原真菌的抑菌效果，并對(duì)活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取相進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析（GC-MS）鑒定主要化學(xué)成分，用面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)含量。結(jié)果表明：15株核桃葉部?jī)?nèi)生真菌的發(fā)酵濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用，占內(nèi)生真菌總數(shù)的75.0%。其中黑孢霉屬（Nigrospora）Y4菌株對(duì)8種病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率均大于60%，抑菌譜廣泛。Y4菌株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最大，抑制率達(dá)95.95%，其次是蘋果果腐病菌（84.81%）。Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取相Fr4組分經(jīng)GC-MS分析共鑒定出14種化合物，占出峰物質(zhì)總量的89.58%。其中哌草丹相對(duì)含量最高，達(dá)到50.46%，其他物質(zhì)主要是有機(jī)酸類化合物。由此可知，核桃內(nèi)生真菌具有廣泛的抑菌譜，活性菌株Y4發(fā)酵產(chǎn)物可望研發(fā)出新型微生物源除草劑。

關(guān)鍵詞：核桃；內(nèi)生真菌；抑菌活性；氣質(zhì)聯(lián)用；微生物源除草劑

中圖分類號(hào)：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0292-03

收稿日期：2013-12-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30972315）。

作者簡(jiǎn)介：李麗（1986—），女，山東臨沂人，碩士，從事樹(shù)木提取物化學(xué)與工程方向的研究。E-mail：zyqlili@163.com。

通信作者：翟梅枝，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物資源利用與植物病害防治的研究。E-mail：plum-zhai@163.com。植物內(nèi)生真菌是指那些生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙，沒(méi)有引起宿主明顯病害癥狀的真菌[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤[2-4]、抑菌[5-6]、抗氧化[7]等活性。1993年Stierle等從太平洋紅豆杉樹(shù)皮中分離得到具有抗腫瘤活性的紫杉醇內(nèi)生真菌[8]，這一發(fā)現(xiàn)使利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)藥物活性化合物成為國(guó)內(nèi)外研究的新熱點(diǎn)[9]。

核桃（Juglans regia L.）是核桃屬植物中分布最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的栽培種。核桃屬植物次生物質(zhì)具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、化感、殺蟲等多種生物活性[10-11]。由于植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，本研究對(duì)從健康核桃葉部分離得到的20株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性篩選，并對(duì)活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的有效成分進(jìn)行初步研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物作為微生物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試內(nèi)生真菌20株核桃內(nèi)生真菌于2011年5月從健康核桃葉中分離獲得，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃研究中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDL）：馬鈴薯20%（取汁），葡萄糖2%，1×105 Pa滅菌25 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂，1×105 Pa滅菌25 min。

1.1.3供試病原菌蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、小麥赤霉病菌（Gibberella zeae）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、蘋果果腐病菌（Phacidiopycnis washingtonensis）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、黃瓜黃萎病菌（Cucumis dahliae）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。

1.1.4儀器與試劑Trace GC ultra-DSQ Ⅱ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技有限公司）；R502B型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1核桃內(nèi)生真菌的培養(yǎng)從試管保藏斜面挑取適量菌種Y4，接種于PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3，在菌落邊緣取直徑5 mm的菌絲塊轉(zhuǎn)接到裝有400 mL PDL的1 L搖瓶中，180 r/min下 25 ℃培養(yǎng)12 d。共發(fā)酵10 L。

1.2.2抑菌活性測(cè)定Y4菌株發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法[12]。以空白培養(yǎng)基處理為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)72～96 h后，用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑，取其平均值。按照下式計(jì)算抑制率：

菌落生長(zhǎng)直徑（mm）=3次直徑平均值-5.0（菌餅直徑）；

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑菌）/ 對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.2.3發(fā)酵浸膏的制備采用溶劑萃取法，發(fā)酵液減壓濃縮后，依次采用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并將各萃取液減壓濃縮，獲得菌液濃縮物；菌絲于45 ℃烘干后，依次采用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并將各萃取液減壓濃縮，獲得菌絲濃縮物。根據(jù)TLC顯示結(jié)果，菌液與菌絲的相同溶劑萃取組分基本一致，將相同溶劑萃取的菌液濃縮物和菌絲濃縮物合并待用。

1.2.4硅膠柱層析收集活性成分將乙酸乙酯相濃縮物溶解，拌硅膠過(guò)柱，選用石油醚-丙酮梯度洗脫，收集各組分。將分離的各組分分別用不同的展開(kāi)劑展開(kāi)，然后通過(guò)紫外燈（365 nm）、碘蒸氣和5%的濃硫酸乙醇溶液檢測(cè)，以確定其組分與含量。

1.2.5成分測(cè)定氣相色譜條件：色譜柱BP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫，柱溫50 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持15 min；載氣（氦氣）體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比20 ∶1。質(zhì)譜條件：EI源，電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍 30～650 aum，溶劑延遲3 min，傳輸線溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度 280 ℃，掃描速率3.8次/s。

數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

2結(jié)果

2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑菌作用

研究表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用（表1），占供試內(nèi)生真菌總數(shù)的75%；至少對(duì)4種病原菌抑制作用達(dá)40%以上的有8株，占總數(shù)的40%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株，占總數(shù)的25%，分別是菌株Y4、Y6、Y10、Y11和Y12。

20 株內(nèi)生真菌對(duì)8種供試植物病原菌的抑制作用具有一定差異。對(duì)黃瓜黃萎病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果果腐病菌的抑制作用在40%以上的分別有7、8、8株。對(duì)葡萄炭疽病菌、番茄早疫病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用在40%以上的均有9株，占總數(shù)的45%。對(duì)小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用在40%以上的均有11株，占總數(shù)的55%。

Y6和Y10菌株除對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制率接近50%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于50%；Y20菌株對(duì)蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用均大于70%；Y1菌株對(duì)蘋果果腐病菌和葡萄炭疽病菌的抑制作用均大于90%；Y4、Y11、Y12和Y20這4株菌株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用均大于90%；其中Y4菌株對(duì)8種病原菌的抑制作用最強(qiáng)，除對(duì)蘋果腐爛率的抑制率（59.60%）接近60%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于60%，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最大，抑制率達(dá)95.95%，其次是蘋果果腐病菌（84.81%），對(duì)小麥赤霉病菌、葡萄炭疽病菌和黃瓜黃萎病菌的抑制效果差別不大，抑制率均大于70%。由此可知，Y4菌株為活性較高、抑菌譜廣泛的菌株。表1核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑制作用

3討論與結(jié)論

通過(guò)抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)試結(jié)果表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用，占供試

內(nèi)生真菌總數(shù)的75.0%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株。Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種常見(jiàn)病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的抑制作用具有廣譜性。翟梅枝等從核桃、黑核桃的莖、葉和青皮中分離得到60株內(nèi)生真菌，也具有廣泛的抗菌譜[13]。從核桃根部分離得到1株葡萄殼小圓孢菌內(nèi)生真菌G8，其發(fā)酵液的提取物對(duì)28種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物的抑制效果最好，對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果腐爛病菌、小麥根腐病菌、稻瘟病菌4種病原菌的抑制率為100%[14]。以上研究結(jié)果說(shuō)明從核桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中表2核桃內(nèi)生真菌Y4的發(fā)酵產(chǎn)物化學(xué)成分分析結(jié)果

本試驗(yàn)還在發(fā)酵液中鑒定出闊草克，其乙酯形式為4-氯-2-氧代苯并噻唑-3-基乙酸乙酯，是一種選擇性高的芽后油菜田闊葉草處理劑，屬于有機(jī)雜環(huán)類除草劑。該除草劑可芽后使用，防治繁縷、牛繁縷、雀舌草、豬殃殃等闊葉雜草，對(duì)油菜及后茬作物安全無(wú)害。同時(shí)，該品與防除禾本科雜草的芽后除草劑復(fù)配可一次性防除油菜田的禾本科和闊葉雜草[19]。綜上所述，利用Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物可望研發(fā)出新型微生物源除草劑。

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數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

2結(jié)果

2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑菌作用

研究表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用（表1），占供試內(nèi)生真菌總數(shù)的75%；至少對(duì)4種病原菌抑制作用達(dá)40%以上的有8株，占總數(shù)的40%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株，占總數(shù)的25%，分別是菌株Y4、Y6、Y10、Y11和Y12。

20 株內(nèi)生真菌對(duì)8種供試植物病原菌的抑制作用具有一定差異。對(duì)黃瓜黃萎病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果果腐病菌的抑制作用在40%以上的分別有7、8、8株。對(duì)葡萄炭疽病菌、番茄早疫病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用在40%以上的均有9株，占總數(shù)的45%。對(duì)小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用在40%以上的均有11株，占總數(shù)的55%。

Y6和Y10菌株除對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制率接近50%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于50%；Y20菌株對(duì)蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用均大于70%；Y1菌株對(duì)蘋果果腐病菌和葡萄炭疽病菌的抑制作用均大于90%；Y4、Y11、Y12和Y20這4株菌株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用均大于90%；其中Y4菌株對(duì)8種病原菌的抑制作用最強(qiáng)，除對(duì)蘋果腐爛率的抑制率（59.60%）接近60%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于60%，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最大，抑制率達(dá)95.95%，其次是蘋果果腐病菌（84.81%），對(duì)小麥赤霉病菌、葡萄炭疽病菌和黃瓜黃萎病菌的抑制效果差別不大，抑制率均大于70%。由此可知，Y4菌株為活性較高、抑菌譜廣泛的菌株。表1核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑制作用

3討論與結(jié)論

通過(guò)抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)試結(jié)果表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用，占供試

內(nèi)生真菌總數(shù)的75.0%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株。Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種常見(jiàn)病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的抑制作用具有廣譜性。翟梅枝等從核桃、黑核桃的莖、葉和青皮中分離得到60株內(nèi)生真菌，也具有廣泛的抗菌譜[13]。從核桃根部分離得到1株葡萄殼小圓孢菌內(nèi)生真菌G8，其發(fā)酵液的提取物對(duì)28種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物的抑制效果最好，對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果腐爛病菌、小麥根腐病菌、稻瘟病菌4種病原菌的抑制率為100%[14]。以上研究結(jié)果說(shuō)明從核桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中表2核桃內(nèi)生真菌Y4的發(fā)酵產(chǎn)物化學(xué)成分分析結(jié)果

本試驗(yàn)還在發(fā)酵液中鑒定出闊草克，其乙酯形式為4-氯-2-氧代苯并噻唑-3-基乙酸乙酯，是一種選擇性高的芽后油菜田闊葉草處理劑，屬于有機(jī)雜環(huán)類除草劑。該除草劑可芽后使用，防治繁縷、牛繁縷、雀舌草、豬殃殃等闊葉雜草，對(duì)油菜及后茬作物安全無(wú)害。同時(shí)，該品與防除禾本科雜草的芽后除草劑復(fù)配可一次性防除油菜田的禾本科和闊葉雜草[19]。綜上所述，利用Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物可望研發(fā)出新型微生物源除草劑。

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數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索：通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

2結(jié)果

2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑菌作用

研究表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用（表1），占供試內(nèi)生真菌總數(shù)的75%；至少對(duì)4種病原菌抑制作用達(dá)40%以上的有8株，占總數(shù)的40%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株，占總數(shù)的25%，分別是菌株Y4、Y6、Y10、Y11和Y12。

20 株內(nèi)生真菌對(duì)8種供試植物病原菌的抑制作用具有一定差異。對(duì)黃瓜黃萎病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果果腐病菌的抑制作用在40%以上的分別有7、8、8株。對(duì)葡萄炭疽病菌、番茄早疫病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用在40%以上的均有9株，占總數(shù)的45%。對(duì)小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用在40%以上的均有11株，占總數(shù)的55%。

Y6和Y10菌株除對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制率接近50%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于50%；Y20菌株對(duì)蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用均大于70%；Y1菌株對(duì)蘋果果腐病菌和葡萄炭疽病菌的抑制作用均大于90%；Y4、Y11、Y12和Y20這4株菌株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用均大于90%；其中Y4菌株對(duì)8種病原菌的抑制作用最強(qiáng)，除對(duì)蘋果腐爛率的抑制率（59.60%）接近60%外，對(duì)其余7種病原菌的抑制率均大于60%，對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最大，抑制率達(dá)95.95%，其次是蘋果果腐病菌（84.81%），對(duì)小麥赤霉病菌、葡萄炭疽病菌和黃瓜黃萎病菌的抑制效果差別不大，抑制率均大于70%。由此可知，Y4菌株為活性較高、抑菌譜廣泛的菌株。表1核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種病原菌的抑制作用

3討論與結(jié)論

通過(guò)抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)試結(jié)果表明，有15株內(nèi)生真菌的培養(yǎng)濾液對(duì)8種供試病原菌均有一定抑制作用，占供試

內(nèi)生真菌總數(shù)的75.0%；對(duì)8種病原菌抑制作用均達(dá)到40%以上的有5株。Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)8種常見(jiàn)病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的抑制作用具有廣譜性。翟梅枝等從核桃、黑核桃的莖、葉和青皮中分離得到60株內(nèi)生真菌，也具有廣泛的抗菌譜[13]。從核桃根部分離得到1株葡萄殼小圓孢菌內(nèi)生真菌G8，其發(fā)酵液的提取物對(duì)28種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物的抑制效果最好，對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果腐爛病菌、小麥根腐病菌、稻瘟病菌4種病原菌的抑制率為100%[14]。以上研究結(jié)果說(shuō)明從核桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中表2核桃內(nèi)生真菌Y4的發(fā)酵產(chǎn)物化學(xué)成分分析結(jié)果

本試驗(yàn)還在發(fā)酵液中鑒定出闊草克，其乙酯形式為4-氯-2-氧代苯并噻唑-3-基乙酸乙酯，是一種選擇性高的芽后油菜田闊葉草處理劑，屬于有機(jī)雜環(huán)類除草劑。該除草劑可芽后使用，防治繁縷、牛繁縷、雀舌草、豬殃殃等闊葉雜草，對(duì)油菜及后茬作物安全無(wú)害。同時(shí)，該品與防除禾本科雜草的芽后除草劑復(fù)配可一次性防除油菜田的禾本科和闊葉雜草[19]。綜上所述，利用Y4菌株發(fā)酵產(chǎn)物可望研發(fā)出新型微生物源除草劑。

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