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    紅火蟻告警信息素的GC-EAD分析

    2014-11-22 05:41:00劉先福李俊凱
    生物安全學(xué)報(bào) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:分析

    劉先福,陳 立,李俊凱

    1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州434025;2中國科學(xué)院動物研究所,農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100101

    信息素(pheronmone)在協(xié)調(diào)社會性昆蟲個(gè)體之間的生理和行為活動及完成整個(gè)群體生存所必要的活動方面起著重要的作用,對于其完成認(rèn)同與集群、識別、生殖、報(bào)警和防御等社會性通訊尤為重要。根據(jù)螞蟻家族個(gè)體分工的不同,螞蟻信息素大致可分為3 類,即蟻后信息素(queen-produced pheromone)、工蟻信息素(worker-derived pheromone)和幼蟲信息素(brood-produced pheromone)(Rosen et al.,1996)。工蟻的主要功能是覓食、防御,所以工蟻釋放的信息素主要有兩大類:一種是由頭部上顎腺分泌的告警信息素(alarm pheronmone),能讓蟻群免于外敵入侵而遭受侵害;另外一種是由腹部杜氏腺分泌的跟蹤信息素(trail pheronmone),具有高效的覓食和招募功能(Wilson,1962)。這2 類信息素保證了工蟻個(gè)體間的信息交流。

    通常在反擊過程中,告警信息素能夠加強(qiáng)螞蟻的移動速度和進(jìn)攻強(qiáng)度(Brown et al.,1970)。然而,對于螞蟻這種個(gè)體較小,且蟻巢內(nèi)相互交流較少的種群,告警信息素更多的是起到一個(gè)及時(shí)疏散成員的作用(Regnier & Wilson,1969)。關(guān)于螞蟻告警信息素的化學(xué)成分研究已有大量報(bào)道(Bradsha et al.,1975;Hernandez et al.,1999;Wheeler et al.,1975)。第1 個(gè)告警信息素是從切葉蟻Atta texana Buckley 體內(nèi)提取、分離得到,其主要成分是4-甲基-3-庚酮(Moser et al.,1968)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),4-甲基-3-庚酮還能引起A.texana (Buckley)、A.robusta Borgmeier、A.bisphaerica Forel、A.capiguara Gon alves 和A.sexdens (L.)等5 種螞蟻的告警行為(Blum,1968;Moser et al.,1968;Riley et al.,1974)。而據(jù)研究報(bào)道,紅火蟻Solenopsis invicta Buren 的告警信息素的主要成分是2-乙基-3,6-二甲基吡嗪(Vandermeer et al.,2010)。

    人工合成的2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的比例為45%:55%的2-乙基-3,6-二甲基吡嗪和其同分異構(gòu)體2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的混合物(Sugimoto et al.,2006)。由于沒有紅火蟻告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品純品,在利用告警信息素樣品做生物試驗(yàn)時(shí),必須考慮到混合物的作用。這一對異構(gòu)體可在氣相色譜柱上分開,所以用氣相色譜—觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)分析紅火蟻工蟻對告警信息素混合物中2 種化合物的電生理反應(yīng)時(shí),就能驗(yàn)證紅火蟻告警信息素混合物中的有效成分,為進(jìn)一步研究告警信息素對紅火蟻告警行為的調(diào)控提供參考。紅火蟻告警信息素在紅火蟻體內(nèi)屬于極微量化合物,本試驗(yàn)擬用柱層析法分離大量紅火蟻浸提液,然后與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比GC-MS 離子圖,以確定是否能得到紅火蟻告警信息素流分。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料及儀器

    1.1.1 供試蟲源 紅火蟻種群采自紅火蟻發(fā)生區(qū)廣東省廣州市及周邊幾個(gè)地區(qū)。從野外采回的紅火蟻,在實(shí)驗(yàn)室利用“水試管”提供清水和10%的蜂蜜水,每天每巢投放3 ~5 頭黃粉蟲Tenebrio molitor L.(呂利華等,2006)。

    1.1.2 主要試劑及儀器 正己烷,色譜純,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;丙酮,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;高純氮?dú)?、氦氣,北京千禧京城氣體銷售中心;聚四氟乙烯乳液,廣州興勝杰科技有限公司;硅膠柱,內(nèi)徑22 mm,北京欣維爾玻璃儀器有限公司;硅膠粉,300 ~400 目,青島海洋化工廠。氣相色譜儀GC7890A、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS,7890A-5975C,美國Agilent Technologies 公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 紅火蟻告警信息素分離分析 將200 g 紅火蟻工蟻置于-20 ℃的冰箱中冷凍60 min,用470 mL色譜純級正己烷浸提48 h,取出浸提液,加入30 g無水硫酸鈉,處理12 h 后取出,置于4 ℃冰箱冷藏待用。告警信息素標(biāo)品為2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪,濃度為1 μg·μL-1,溶劑為色譜純級正己烷。

    取上述工蟻浸提液,用硅膠柱層析法(80.0 g,300 ~400 目硅膠載入直徑22 mm 層析柱)分離含有吡嗪的流分。用正己烷與丙酮按比例沖洗層析柱,每管收集2 mL 為1 個(gè)流分,然后用GC 測定每個(gè)流分 的化 學(xué)成 分(Chen & Fadamiro,2009a、2009b)。柱層析分離所收集的流分樣品用Agilent 7890A 氣相色譜儀進(jìn)行分析,色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm film thickness,Agilent Technologies),進(jìn)樣量1 μL,無分流進(jìn)樣。樣品檢測程序:進(jìn)樣口溫度230 ℃,程序升溫起始溫度50 ℃,以5 ℃·min-1的速率升至100 ℃,以10 ℃·min-1的速率升至240 ℃,保持4 min,總共分析時(shí)間30 min。檢測器為火焰離子檢測器(FID),溫度260 ℃。將GC 色譜圖相同或相近的流分合并成1 個(gè)流分。同時(shí)進(jìn)一針標(biāo)準(zhǔn)樣品,通過對比GC 保留時(shí)間來確定吡嗪流分,然后將吡嗪流分濃縮至1 mL,進(jìn)行GC-MS 分析。用GC-MS 分析過柱收集到的吡嗪流分和告警信息素標(biāo)品混合物,對比2 組數(shù)據(jù)的離子峰和保留時(shí)間,確定樣品中吡嗪流分中的告警信息素成分。

    1.2.2 紅火蟻告警信息素混合物氣相色譜—觸角電位聯(lián)用(GC-EAD)分析 EAG 試驗(yàn)所用緩沖液為Ringer's 生理鹽水,各組分配比為氯化鈉0.75 g,氯化鉀0.035 g,氯化鈣0.029 g,水100 g。將銀絲插入2 個(gè)電極中,挑選1 對端口較小的玻璃毛細(xì)管,作記錄和參比電極。

    挑選1 頭體型較大的工蟻,放置在玻片上,用手術(shù)刀快速切下頭部,切口端與充滿Ringer's 生理鹽水的參比電極相連,觸角的尖端連接記錄電極。電極通過鍍氯化銀銀絲與信號放大器連接,信號通過探針監(jiān)測(PRG-3,Syntech?,the Netherlands),用GC-EAD 軟件(Syntech?,the Netherlands)記錄和分析數(shù)據(jù)(Chen & Fadamiro,2007)。

    GC-EAD 分析色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱,進(jìn)樣量2 μL,無分流進(jìn)樣。色譜條件同1.2.1。測試的樣品為2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪,即告警信息素混合物,濃度1 μg·μL-1。程序結(jié)束后保存FID離子檢測圖與EAD 圖譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅火蟻告警信息素分離分析

    紅火蟻工蟻浸提液通過硅膠柱層析分離,用正己烷和丙酮溶劑體系能夠分離得到告警信息素流分,經(jīng)過GC-FID 分析濃縮得到1 mL 吡嗪流分。對樣品中吡嗪流分和標(biāo)準(zhǔn)樣品中告警信息素混合物進(jìn)行GC-MS 分析,得到2 個(gè)樣品的GC-MS 總離子色譜圖(圖1),色譜峰1 的質(zhì)譜圖見圖2。由圖1可知,提取物樣品中吡嗪流分的色譜圖中在11.45 min 出現(xiàn)了一個(gè)峰,經(jīng)質(zhì)譜鑒定以及與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比保留時(shí)間,發(fā)現(xiàn)吡嗪流分中的峰1 和合成標(biāo)準(zhǔn)品混合物中峰1 是同一種化合物。通過比對文獻(xiàn)中合成吡嗪混合物的色譜圖出峰順序和含量比,確定峰1 是2-乙基-3,6-二甲基吡嗪,峰2 是2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(Sugimoto et al.,2006)。此結(jié)果說明,大量紅火蟻工蟻浸提液過柱能夠得到告警信息素的成分,但含量非常低。

    圖1 紅火蟻工蟻浸提物中吡嗪流分(A)和告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物(B)的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the pyrazinefraction of the body extract from workers of S.invicta (A)and synthetic alarm pheromone component mixture(B)

    2.2 紅火蟻告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物GC-EAD分析

    紅火蟻工蟻對告警信息素混合物GC-EAD 反應(yīng)如圖3。合成告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品為2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪的混合物,經(jīng)過GC-EAD 分析,發(fā)現(xiàn)紅火蟻工蟻對2 種化合物均有電生理反應(yīng),其中活性高的為化合物1,活性低的為化合物2。與GCMS 離子圖譜比對,發(fā)現(xiàn)化合物1 為2-乙基-3,6-二甲基吡嗪,化合物2 為2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。GC-EAD 結(jié)果證實(shí)紅火蟻工蟻對2-乙基-3,6-二甲基吡嗪(即告警信息素)的電生理反應(yīng)比對其同分異構(gòu)體2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的反應(yīng)大。

    圖2 2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of 2-ethyl-3,6-dimethylpyrazine

    圖3 紅火蟻工蟻對告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的GC-EAD 反應(yīng)Fig.3 GC-EAD analysis of S.invicta workers to the synthetic alarm pheromone component mixture

    3 討論

    本研究將大量紅火蟻浸提液經(jīng)硅膠柱層析分離,得到含告警信息素的流分,與2-乙基-3,5(6)-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜圖保留時(shí)間對比,確定告警信息素流分含有2-乙基-3,6-二甲基吡嗪。將標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物進(jìn)行GC-EAD 分析,紅火蟻工蟻對2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的電生理反應(yīng)活性比對2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的高。

    由于告警信息素屬于小分子易揮發(fā)物質(zhì),利用柱層析方法洗脫分離較難得到該組分,會讓大量的物質(zhì)揮發(fā)損失;另外,試驗(yàn)選用的紅火蟻是凍死之后的工蟻,紅火蟻在被凍死過程中可能會釋放告警信息素,也會影響告警信息素的提取效率。因此,下一步可改進(jìn)提取方法,如利用動態(tài)頂空吸附、固相微萃取等。另外,還可對已鑒定出來的告警信息素及一系列吡嗪類似物做電生理反應(yīng)及行為反應(yīng)測試,探討吡嗪類似物對紅火蟻行為的影響。

    呂利華,馮夏,陳煥瑜,劉杰,劉曉燕,何余容.2006.介紹紅火蟻的野外采集和實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的方法.昆蟲知識,43(2):265-267.

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