不同溫度下白僵菌Bb04菌株對(duì)紅火蟻工蟻的致病力

劉曉燕，呂利華，何余容*

1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)紅火蟻研究中心，廣東 廣州510642;2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東 廣州510640

紅火蟻Solenopsis invicta Buren 屬膜翅目Hymenoptera 蟻科Formicidae 切葉蟻亞科Mymicinae 火蟻屬Solenopsis，是世界上危害最嚴(yán)重的入侵有害生物之一(曾玲等，2005)。紅火蟻原分布于南美的巴拉納河流域(Buren et al.，1974)，1930年紅火蟻入侵美國(guó)阿拉巴馬州莫比爾(Vinson，1997)。目前，紅火蟻已擴(kuò)散至美國(guó)13 個(gè)洲和波多黎哥的1.2 億hm2的區(qū)域(Callcott，2002;Callcott ＆ Collins，1996)，在眾多的加勒比海島嶼定殖(Davis et al.，2001)。2001年紅火蟻入侵新西蘭(Pascoe，2001)和澳大利亞(Natrass ＆ Vanderwoude，2001)。2003年紅火蟻入侵中國(guó)臺(tái)灣，2005年入侵中國(guó)大陸(曾玲等，2005)。

白僵菌是一種應(yīng)用最廣泛的蟲(chóng)生真菌，其已知寄主昆蟲(chóng)達(dá)200 種以上，被用于工廠化大量生產(chǎn)，可防治30 種農(nóng)林害蟲(chóng)(高崇省和趙森，1996)。白僵菌屬真菌被認(rèn)為是紅火蟻生物防治最有前途的真菌之一(Lofgren et al.，1975)。當(dāng)從紅火蟻上分離出球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals)Vuill.后(Alves et al.，1988;Stimac et al.，1987)，便被應(yīng)用于紅火蟻的防治。在巴西，田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，約80%的紅火蟻因球孢白僵菌感染而死亡(Stimac et al.，1989)。球孢白僵菌雖然能寄生多種昆蟲(chóng)，但不同菌株對(duì)寄主的專化性和致病力有一定差異(蒲蟄龍，1978)，其致病力主要取決于菌株、害蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)及環(huán)境條件等因素(蒲蟄龍，1994)。國(guó)內(nèi)外均有白僵菌在不同溫度下對(duì)不同寄主致病力的研究(何余容等，2005;林華峰等，1998a、1998b;劉銀泉等，2000;孫魯娟等，2001;王曉紅等，2007;Pandey ＆ Kanaujia，2004)。

在室內(nèi)篩選對(duì)紅火蟻具高致病力菌株的過(guò)程中，一株原始分離自橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis Hendel 的球孢白僵菌B.bassiana Bb04 菌株表現(xiàn)出對(duì)紅火蟻工蟻較強(qiáng)的致病力和較快的致死速率(呂利華等，2011)，顯示出該株球孢白僵菌在紅火蟻的生物防治中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。為了更好地利用該白僵菌菌株防治紅火蟻，本試驗(yàn)就溫度對(duì)白僵菌Bb04 菌株致病力的影響進(jìn)行初步研究，以期找出有利于白僵菌侵染紅火蟻合適的溫度范圍，從而為制定田間應(yīng)用白僵菌防治紅火蟻的最佳時(shí)期奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

供試紅火蟻采自廣州市南沙區(qū)，于室內(nèi)飼養(yǎng)，選取健康紅火蟻工蟻。紅火蟻蟻群的田間采集、室內(nèi)蟻群的分離及飼養(yǎng)參照呂利華等(2006)方法。

1.2 供試菌株和孢子懸浮液的制備

將分離自橘小實(shí)蠅的球孢白僵菌SCAU-Bb04菌株，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)，用甘油試管法保存分生孢子于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃的超低溫冰箱中。試驗(yàn)時(shí)取出活化，轉(zhuǎn)接于PDA 平板并保存于4 ℃冰箱中，待用。

將白僵菌Bb04 菌株接于PDA 平板，放入25 ℃、光照周期12L:12D 的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d。待菌落產(chǎn)孢后，加入20 mL 0.03%吐溫-80 無(wú)菌水，用接種針輕刮菌絲及孢子制成菌液。將菌液倒入200 mL燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min。待孢子完全分散后，用雙層醫(yī)用紗布過(guò)濾菌液，獲得孢子懸浮液，即供試母液，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)母液的孢子濃度，再稀釋成1 ×105和1 ×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。

1.3 試驗(yàn)用人工氣候箱

型號(hào)RXZ-300B，溫度靈敏度±1 ℃，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司。

1.4 不同溫度下白僵菌對(duì)紅火蟻致病力的測(cè)定

采用噴霧法測(cè)定。用小型手動(dòng)噴霧器(太陽(yáng)神牌128 微型噴壺)將配制好的孢子懸浮液噴于100頭紅火蟻工蟻蟲(chóng)體上。0.03%吐溫-80 無(wú)菌水處理作為空白對(duì)照。每處理100 頭蟲(chóng)，3 次重復(fù)。將處理后的紅火蟻工蟻放入底部鋪有2 ～3 mm 厚石膏的有蓋塑料杯中(底部直徑7 cm，頂部直徑9 cm，高6.5 cm)，在石膏中加入少許水，保濕。在杯蓋上扎若干小孔，以便透氣，在塑料杯內(nèi)壁涂少量滑石粉，防紅火蟻逃逸。將處理的供試蟲(chóng)體分別置于17、21、25、29 和33 ℃5 個(gè)恒溫條件下培養(yǎng)，相對(duì)濕度85%以上，用棉花球吸取25%的蜂蜜水喂食紅火蟻。每日檢查并記錄紅火蟻的死亡數(shù)，連續(xù)觀察15 d。根據(jù)蟲(chóng)體是否長(zhǎng)出菌絲確定其死因，歸類計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(DPS)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)(唐啟義和馮明光，2000)，計(jì)算致死中時(shí)(LT50)，利用多重比較法比較處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下紅火蟻工蟻的逐日累計(jì)死亡情況

在不同溫度下接種白僵菌Bb04 菌株的紅火蟻工蟻逐日累計(jì)死亡率見(jiàn)圖1。由圖1A 可知，1 ×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液處理的紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率逐日上升緩慢，各溫度條件下第15 天的累計(jì)死亡率均未超過(guò)40%。圖1B 顯示，1 ×108個(gè)·mL-1孢子懸浮液處理的紅火蟻工蟻，在25 和29 ℃條件下，第2 天開(kāi)始感病死亡，之后累計(jì)死亡率增加迅速，在第4 天累計(jì)死亡率已超過(guò)90%;而在17 ℃下，紅火蟻工蟻到第7 天累計(jì)死亡率才達(dá)到90%。

圖1 不同溫度下紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率Fig.1 Daily cumulative mortality of red imported fire ants inoculated by B.bassiana under different temperatures

2.2 不同溫度下紅火蟻工蟻的死亡率

不同溫度下第15 天紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在17 ～33 ℃，白僵菌Bb04菌株均能侵染紅火蟻工蟻，但在21、25 和29 ℃條件下，1 ×108個(gè)·mL-1孢子懸浮液處理的紅火蟻工蟻在第15 天的累計(jì)死亡率均達(dá)100%，而在17和33 ℃時(shí)，其死亡率分別為99.36%和98.74%;在21、25、29 和33 ℃條件下，1 ×105個(gè)·mL-1孢子懸浮液處理的紅火蟻工蟻在第15 天的累計(jì)死亡率分別為29.42%、36.18%、33.17%和27.21%，這4 個(gè)溫度處理之間的累計(jì)死亡率差異不顯著，但均顯著高于17 ℃紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率。

表1 不同溫度下白僵菌Bb04 菌株處理的紅火蟻工蟻累計(jì)死亡率Table 1 Cumulative mortality induced by the isolate Bb04 of entomopathogenic fungus B.bassiana at different temperatures

2.3 不同溫度下白僵菌對(duì)紅火蟻工蟻致病力的時(shí)間效應(yīng)

將不同溫度下用2 個(gè)濃度白僵菌Bb04 菌株處理后的紅火蟻工蟻致病力數(shù)據(jù)進(jìn)行機(jī)率值分析，得出其時(shí)間效應(yīng)方程，求出致死中時(shí)(LT50)(表2)。由表2可以看出，在17 ～25 ℃，白僵菌Bb04 菌株對(duì)紅火蟻工蟻的LT50隨著溫度的升高而縮短。當(dāng)溫度為29 和33 ℃時(shí)，紅火蟻的LT50不減少反而增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在25 ～29 ℃下，白僵菌Bb04菌株對(duì)紅火蟻工蟻的致病力最強(qiáng)，是田間最適宜防治紅火蟻的溫度范圍。

表2 不同溫度下2 個(gè)濃度白僵菌處理的紅火蟻工蟻的時(shí)間效應(yīng)方程Table 2 Equation of time effect on RIFA worker induced by isolate of entomopathogenic fungus B.bassiana at two concentrations at different temperatures

3 討論

本研究表明，在25 ℃，相對(duì)濕度85%以上，白僵菌處理濃度為1 ×108個(gè)·mL-1時(shí)，對(duì)紅火蟻的致病力最高，致時(shí)中時(shí)最短，致死速率最快，第6 天的累計(jì)死亡率已達(dá)100%，致死中時(shí)(LT50)為2.57 d。據(jù)報(bào)道，白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期(如菌絲生長(zhǎng)期和產(chǎn)孢期)的最適溫度不盡相同，最有利于白僵菌菌絲生長(zhǎng)的溫度為25 ℃(孫魯娟等，2001)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，25 ℃時(shí)白僵菌對(duì)紅火蟻的致病力最強(qiáng)，與菌絲生長(zhǎng)的最適溫度相吻合。

不同溫度下白僵菌有不同的侵染途徑。在適宜溫、濕度下，主要從體壁侵染，而在低溫環(huán)境下，則以消化道侵入為主(林華峰等，1998a)。在相對(duì)濕度為(90 ±10)%的情況下，高溫更有利于白僵菌的萌發(fā)侵入;低溫時(shí)，孢子萌發(fā)率低，甚至不萌發(fā)，侵入昆蟲(chóng)的速度較慢，主要依賴于隨食物進(jìn)入消化道的分生孢子進(jìn)行侵染(孫魯娟等，2001)。本試驗(yàn)相對(duì)濕度控制在85%以上，在此條件下，當(dāng)白僵菌孢子懸浮液的濃度為1 ×105個(gè)·mL-1時(shí)，低溫下(17 ℃)15 d 紅火蟻工蟻的累計(jì)死亡率最低，表明低溫不利于孢子的侵入;而當(dāng)孢子濃度為1 ×108個(gè)·mL-1時(shí)，33 ℃時(shí)紅火蟻工蟻15 d 的累計(jì)死亡率最低。此結(jié)果說(shuō)明，蟲(chóng)生真菌對(duì)寄主的入侵不僅與溫、濕度等環(huán)境條件有關(guān)，還與菌液濃度有關(guān)，許多有關(guān)白僵菌對(duì)害蟲(chóng)致病力的研究(何余容等，2005;林華峰等，1998a、1998b;劉銀泉等，2000;孫魯娟等，2001;王曉紅等，2007)均證明了這一點(diǎn)。

本研究得出的試驗(yàn)結(jié)果與前人研究的有關(guān)白僵菌對(duì)其他昆蟲(chóng)的致病力所得出的結(jié)論存在一定差異，除試驗(yàn)條件不同外，還可能與病原菌的致病力和寄主的感病性有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探討。但從白僵菌對(duì)紅火蟻的致死中時(shí)及累積死亡率可看出，本試驗(yàn)所用的菌株對(duì)紅火蟻具有較快的致死速度，表明其在紅火蟻的生物防治中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

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