十字花科根腫病研究現(xiàn)狀及展望

杜艷等

摘要：十字花科根腫病是一種世界性的重要病害，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。概述了該病病原菌的生活史、分子檢測、分子致病機(jī)理及根腫病防治等研究現(xiàn)狀，并對其研究趨勢進(jìn)行了展望，以期為我國十字花科根腫病的防治提供參考。

關(guān)鍵詞：十字花科；根腫?。皇|薹根腫菌；致病機(jī)理；防治

中圖分類號： S432.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0122-05

收稿日期：2014-03-19

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）2058]；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號：BK20140748）。

作者簡介：杜艷（1984—），女，安徽阜陽人，博士，助理研究員，從事園藝作物病害及其生物防治研究。E-mail：dy411246508@126.com。

通信作者：劉郵洲，博士，副研究員，從事園藝作物病害生物防治研究。Tel：（025）84390228；E-mail：shitouren88888@163.com。十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的一種重要土傳病害。除了危害十字花科作物油菜、甘藍(lán)、白菜等外，還危害十字花科野生植物薺菜等。根腫病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸（英國，1736），爾后在前蘇聯(lián)（1872）發(fā)現(xiàn)。目前幾乎每個(gè)栽培十字花科作物的國家和地區(qū)都有該病的發(fā)生，全球范圍內(nèi)所造成的作物產(chǎn)量損失占總產(chǎn)量的10%～15%[1]。近年來，根腫病在我國東北、山東青島、長江中上游以及西南等地迅速擴(kuò)大，常年危害面積高達(dá)320萬～400萬hm2，占十字花科作物種植面積的1/3以上[2-3]。隨著十字花科作物種植面積的不斷擴(kuò)大，根腫病給我國十字花科作物的安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀對根腫病作了概述，以期為十字花科根腫病的防治提供參考。

1蕓薹根腫菌的生物學(xué)特性

1.1蕓薹根腫菌的分類地位

蕓薹根腫菌（P. brassicae）由俄國學(xué)者Woronin首次發(fā)現(xiàn)并命名[4]。對于蕓薹根腫菌的分類地位，一直備受爭議。Hawksworth等將其歸為真菌界黏菌門根腫菌綱[5]，而Alexopoulos和Mims將其劃分到真菌界鞭毛菌亞門根腫菌屬[6]。目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是將根腫菌歸到原生動物界根腫菌門根腫菌綱根腫菌屬[7]。

1.2根腫菌的形態(tài)特征

根腫病菌的休眠孢子囊在寄主根部薄壁組織細(xì)胞內(nèi)形成，球形或扁圓形、單胞、無色或略帶灰色，大小1.6～4.6 μm，常密集呈魚卵狀[2]。休眠孢子表面有刺狀突起，掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不同寄主休眠孢子的形態(tài)和大小略有差異。例如：油菜根腫菌休眠孢子平均大小3.5 μm[8]；甘藍(lán)根腫菌休眠孢子平均大小2.5 μm[9]；小白菜根腫菌休眠孢子平均大小2.8 μm[10]。不同寄主游動孢子的形態(tài)和大小也略有不同，掃描電鏡下觀察游動孢子紡錘形或梨形，大小2.8～59 μm，同側(cè)著生不等長的雙鞭毛[11]。另外，黃云等在觀察油菜根腫菌游動孢子的形態(tài)及變化過程時(shí)，首次觀察到侵入結(jié)構(gòu)管腔[8]。

1.3根腫菌的生活史及病害發(fā)生規(guī)律

根腫病菌生活史包括3個(gè)階段：休眠孢子、根毛侵染和皮層侵染（圖1）[12]。休眠孢子黏附在種子或帶有病殘?bào)w的土壤及未腐熟的廄肥中越冬。在條件適宜時(shí)，休眠孢子萌發(fā)釋放一個(gè)橢圓形或者梨形雙鞭毛的游動孢子，稱為初級游動孢子。這些初級游動孢子到達(dá)寄主根毛，穿透根毛細(xì)胞壁，并在其內(nèi)部形成初生原質(zhì)團(tuán)，初生原質(zhì)團(tuán)分裂形成游動孢子囊，每個(gè)游動孢子囊含有4～16個(gè)次級游動孢子，該階段稱為初級侵染階段。隨后，次級游動孢子釋放到土壤中，繼而侵入根表皮，并在根表皮細(xì)胞內(nèi)定殖，形成大量的次級原質(zhì)團(tuán)，次級原質(zhì)團(tuán)經(jīng)減數(shù)分裂形成數(shù)百萬個(gè)休眠孢子，此時(shí)根部腫大形成根瘤，稱為次級侵染階段。當(dāng)根腫組織分解后，這些休眠孢子又釋放到土壤中，從而完成整個(gè)侵染循環(huán)過程。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，休眠孢子萌發(fā)進(jìn)行再侵染。在這一系列過程中，休眠孢子是如何聚集到根部，初級游動孢子能否直接侵入寄主根表皮細(xì)胞，次級游動孢子能否再分化形成初級原生質(zhì)團(tuán)，為何存在初級侵染和次級侵染2個(gè)階段等問題仍然不清楚。

一般認(rèn)為土壤酸堿度和溫濕度與根腫病的發(fā)生非常密切。根腫病發(fā)病的適宜土溫在18～25 ℃，土壤pH值在 5.8～6.5，土壤濕度在60%以上[13]。發(fā)病程度與當(dāng)年的溫度、降雨和土壤pH值等因素有關(guān)，其中溫度對根腫病的發(fā)生至關(guān)重要。當(dāng)溫度低于12 ℃或者高于25 ℃時(shí)，不利于根腫病的發(fā)生[14-15]。Buczacki等認(rèn)為播種后第2周和第3周的溫度和光照水平對根腫病的發(fā)生影響最大[16]。Sharma研究發(fā)現(xiàn)不同溫度條件影響根腫菌侵染寄主，而且發(fā)病的嚴(yán)重程度與溫度有顯著的相關(guān)性[17-18]。

2根腫菌的生理小種鑒定

根腫菌的生理小種鑒定直接關(guān)系到根腫病抗病品種的有效選育，因此國際上一直非常重視根腫菌生理小種的劃分和鑒定。1931年，Honig最先發(fā)現(xiàn)不同來源的根腫菌引起的寄主反應(yīng)存在顯著差異，證實(shí)根腫菌存在小種分化[19]。1965年，Williams采用2個(gè)結(jié)球甘藍(lán)品種Jersey Queen和Badger Shipper以及2個(gè)蕪菁甘藍(lán)品種Laurentian和Wilhelmsburger對多個(gè)國家的根腫菌小種進(jìn)行鑒定，正式提出Williams鑒別系統(tǒng)[20]。隨后，Buczacki等選用國際上不同研究小組的寄主材料于1975年建立了一套ECD（European clubroot differential set）鑒別系統(tǒng)[21]。該系統(tǒng)由B. rapa L. Sensu lato（2n=20）、B. napus L.（2n=38）和B. oleracea L.（2n=18）3組十字花科蕓薹屬寄主組成。自此，Williams和ECD這2套鑒別系統(tǒng)逐漸在歐洲、美國、加拿大、日本、中國等國家應(yīng)用和推廣。然而，這2套鑒別系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。Williams鑒別系統(tǒng)具有鑒別寄主少、容易理解、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是對個(gè)別小種無法明確鑒定，應(yīng)用時(shí)存在一定的局限性。ECD系統(tǒng)雖然對生理小種劃分相對準(zhǔn)確，但是對鑒別寄主要求高，工作量大且命名復(fù)雜，不適于抗病品種的選育。而且，該系統(tǒng)多數(shù)寄主是歐洲油菜品種，在亞洲適用較為困難。此外，國際上還有somé[22]和Kuginuki[23]2套鑒別系統(tǒng)，由于其適用范圍窄，目前應(yīng)用較少[24]。因此，有必要完善和改進(jìn)根腫菌生理小種鑒定系統(tǒng)，從而建立一套更加精確的、科學(xué)的、適合我國致病力分化特點(diǎn)的生理小種鑒定系統(tǒng)，以滿足我國對該病防控的需要。

3根腫菌的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

3.1根腫菌的分子檢測

分子生物技術(shù)的發(fā)展為植物病害診斷提供了重要的技術(shù)手段。1999年，Lto等首次將PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)應(yīng)用到根腫菌的檢測[25]。Manzanares等繪制了不同根腫病菌單孢分離菌群的RAPD圖譜，發(fā)現(xiàn)同屬某一特殊類型的病原菌（P1）有共同的分子標(biāo)記-PL14（1200）[26]。Cao等設(shè)計(jì)1對特異性引物檢測出土壤中含量低于103個(gè)/g的休眠孢子以及被侵染3 d后根組織中的病原菌[27]。由于該引物快捷、簡便、特異性強(qiáng)，目前被廣泛應(yīng)用于根腫菌的檢測。

近年來，陸續(xù)發(fā)展的新技術(shù)（包括巢式PCR、Real-Time PCR技術(shù)等）也被用于根腫病菌的檢測和鑒定。Wallenhammar等成功利用巢式PCR對天然病土進(jìn)行檢測[28]。Sundelin等利用根腫菌侵染后產(chǎn)生的特異性脂肪酸——花生四烯酸（20 ∶4），對土壤及植物組織中的根腫菌進(jìn)行定量檢測[29]。Wallenhammar等又利用熒光定量PCR技術(shù)檢測出土壤中有休眠孢子3 000個(gè)/g[30]。目前，國內(nèi)在根腫菌分子檢測方面也取得了較快的進(jìn)展。楊佩文等設(shè)計(jì)了1對核糖體基因ITS區(qū)段的特異性引物，成功用于不同寄主根腫菌的檢測[31]。尹全等根據(jù)GenBank上已發(fā)表的根腫病菌基因片段序列設(shè)計(jì)了1對特異性引物，有效、快速地檢測病原菌[32]。李金萍等通過熒光定量PCR的方法檢測出土壤中有休眠孢子 1 000個(gè)/g[33]。這些分子檢測技術(shù)為精確預(yù)測田間病害的發(fā)生趨勢、病菌分布及病害防治提供了可靠的依據(jù)。

3.2根腫菌的分子致病機(jī)理

根腫菌是一種非常重要的專性寄生致病菌，明確其致病分子機(jī)理，對培育抗性新品種及病害防治具有重要意義。由于病原菌基因組信息相當(dāng)少，GenBank數(shù)據(jù)庫僅公布了根腫菌的200多個(gè)核苷酸序列。Bulman等利用SSH技術(shù)（supression substractive hybridization）和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)成功克隆了76個(gè)基因的全長或部分序列[34]。目前，已報(bào)道的一些功能基因包括Y10、PbTPS、PbSTKL1、PbBrip9、PbCC249、PRO1[35]。Ito等首次利用RNA指紋技術(shù)（RNA finger printing）和Northern blot技術(shù)，分離和克隆到1個(gè)在根腫菌營養(yǎng)生長階段特異表達(dá)的基因Y10[36]。Brodmann等研究發(fā)現(xiàn)根腫菌侵染寄主時(shí)，其海藻糖-6-磷酸合成酶（由PbTPS編碼）生成大量的海藻糖，影響寄主植物的代謝和生長[37]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過各種方法尋找侵染過程中的差異表達(dá)基因。Ando等利用差異篩選分析法（Differential display analysis）鑒定到1個(gè)PbSTKL1基因，該基因編碼類絲氨酸/蘇氨酸激酶，在根腫菌侵染寄主30 d后表達(dá)量顯著增加[38]。Siemens等通過選取不同的侵染點(diǎn)，檢測了12個(gè)cDNAs的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PbBrip9和 PbCC249 在根腫菌侵染寄主過程中顯著表達(dá)[39]。最近，F(xiàn)eng等鑒定并克隆到1個(gè)絲氨酸蛋白酶Pro1，該蛋白屬于S28蛋白酶家族，具有蛋白酶水解活性，能夠促進(jìn)休眠孢子的萌發(fā)[40]。隨后，F(xiàn)eng等又利用Dot blot和Real-time PCR分析比較，發(fā)現(xiàn)在根腫菌次級游動孢子階段存在著許多上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因，進(jìn)一步闡明了根腫菌存在初級侵染和次級侵染2種不同的侵染機(jī)制[41]。最近，F(xiàn)eng等在根腫菌分子致病機(jī)理方面又有了新的突破[42]。首次通過PEG介導(dǎo)的方法將綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）導(dǎo)入根腫菌菌株中并進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化效率約達(dá)到50%，但轉(zhuǎn)化菌株中未觀察到綠色熒光。近年來，國內(nèi)外雖然在根腫病分子致病機(jī)理方面的研究有所進(jìn)展，但是對致病相關(guān)基因報(bào)道的較少，特別是在侵染過程中如何表達(dá)和調(diào)控的仍不清楚。

4根腫病的防治

4.1抗病品種的選育

根腫病是十字花科作物的重要病害之一，大多數(shù)作物品種對根腫病都是高感的。因此，大多數(shù)育種學(xué)家期望通過鑒定抗根腫病的R基因達(dá)到培育抗病品種的目的。研究表明R基因是一個(gè)多基因家族，這些家族蛋白能夠識別效應(yīng)因子并激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，產(chǎn)生過敏反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)蕓薹屬作物B. rapa含多個(gè)抗根腫病CR基因和1～2個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）[35]。Voorrips報(bào)道一些抗根腫菌的甘藍(lán)（B. oleracea），隨后又從B. oleracea上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)抗根腫病的數(shù)量性狀位點(diǎn)pb-3和pb-4[43]。另外，Manzanares-Dauleux從甘藍(lán)型油菜上分離到1個(gè)抗性基因Pb-Bn1[44]。目前，雖然已有一些商品化的抗性品種，但是單基因抗性強(qiáng)，對病菌的選擇壓力大，根腫菌易出現(xiàn)遺傳和致病力的變化，促進(jìn)新小種的出現(xiàn)，導(dǎo)致有些抗性品種容易失去抗性，因此不斷篩選和培育具有多個(gè)抗性的新品種是今后防治根腫病的目標(biāo)。

4.2農(nóng)業(yè)措施

目前，防治根腫病的農(nóng)業(yè)措施包括3個(gè)方面。一是土壤處理，通過改良土壤，改變土壤酸堿度，以降低根腫病發(fā)病率[45]。鈣鹽處理既可以調(diào)節(jié)土壤的pH值，又可以增加土壤中可交換Ca2+ 的濃度從而減輕病菌的危害[46]。在整地施肥時(shí)，結(jié)合增施熟石灰、草木灰或蛋殼粉等堿性物質(zhì)，改變土壤酸性狀況[47]。另外，研究表明硼處理能夠減少根腫病的發(fā)生概率[48]。二是加強(qiáng)田間管理，農(nóng)用機(jī)械和設(shè)備使用后要及時(shí)清理、消毒，園區(qū)徹底清除病殘?bào)w并燒毀。三是輪作，與非十字花科作物輪作3年以上，能有效減輕根腫病的發(fā)生[49]。

4.3化學(xué)防治

據(jù)報(bào)道，五氯硝基苯、氟啶胺、甲基二硫代氨基甲酸鈉、氰霜唑、百菌清等化學(xué)藥劑對根腫病均有一定的防效[50-51]。播種前用化學(xué)藥劑對種子、苗床、土壤進(jìn)行消毒處理，對根腫病有一定的防治效果。大田試驗(yàn)表明50%氟啶胺和10%氰霜唑?qū)Π撞烁[病具有較好的防治效果[52]。孫道旺等發(fā)現(xiàn)用75%百菌清于苗期灌根2次能有效地防治白菜根腫病，且無農(nóng)藥殘留[53]。李妍等比較灌根法和拌藥法對白菜根腫病的防效，發(fā)現(xiàn)50%氟啶胺懸浮劑拌藥處理的防效更好[54]。

4.4生物防治

除了選育抗病品種、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)措施等手段防治根腫病外，生物防治成為目前防治的一個(gè)重要手段。多年來，人們對生防菌的生防應(yīng)用、生物藥劑的開發(fā)及生防機(jī)制做了大量嘗試和深入的研究。有研究表明，土壤中的生物拮抗菌對根腫菌的防治效果明顯。其中生防真菌主要有莖點(diǎn)霉屬真菌Phoma glomerata[55]、木霉菌Trichoderma（TC32、TC45、TC63）[56]、枝頂孢屬真菌Acremonium alternatum[57]、粘帚菌Gliocladium catenulatum[58]以及大白菜根部的一種內(nèi)生真菌Heteroconium chaetospira[59]。已有研究表明，利用生防細(xì)菌和放線菌對防治根腫病也有一定效果。如細(xì)菌類枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis QST713）[60]、枯草芽孢桿菌（B. subtilis XF-1）[61]以及放線菌Streptomyces isolate S99[56]、Microbispora rosea subsp. rosea（A004、A011）[62]、Streptomyces olivochromogenes（A018）[62]、Streptomyces griseorube（A316、A10）[63]和YN-6[64]都可以有效地控制根腫病。目前，一些生防菌已被開發(fā)和商品化生產(chǎn)，為根腫病的防治提供了新的方向。

5問題與展望

5.1從分子水平上檢測根腫病菌

由于根腫菌具有不同于其他物種的特性，利用分子生物學(xué)方法鑒定病原菌將是未來發(fā)展的趨勢，有利于及時(shí)控制病原菌的傳播及制定有效的防治策略。近年來，分子檢測技術(shù)從最初的普通PCR發(fā)展到熒光定量PCR[65]，然而，分子檢測技術(shù)特別是熒光定量PCR技術(shù)對引物靈敏度和精確度的要求比常規(guī)PCR更高。目前，基于新靶標(biāo)序列建立的檢測體系為病原菌的檢測應(yīng)用提供了理論依據(jù)和方向。例如，用來檢測大豆枯萎病的甾醇14α-去甲基化酶基因（Sterol 14α-de-methylase，CYP51C）的特異序列，相比rDNA-ITS、β-tubulin序列，更加快速、高靈敏度、穩(wěn)定[66]。因此，利用高度保守的基因序列作為分子檢測的新靶標(biāo)建立根腫菌的快速檢測體系，可以為持續(xù)高效控制根腫病提供可靠且準(zhǔn)確的鑒定方法。

5.2加深對根腫菌分子致病機(jī)理的研究

由于根腫菌全基因組信息不足，遺傳轉(zhuǎn)化困難，因此分子致病機(jī)理研究進(jìn)展十分緩慢。近年來，國外對根腫菌致病機(jī)制的研究取得了很大的進(jìn)展。根腫菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，進(jìn)一步加深了對根腫菌致病分子機(jī)制的理解，極大地促進(jìn)了根腫病致病系統(tǒng)中多領(lǐng)域的研究。目前運(yùn)用分子生物學(xué)手段鑒定致病相關(guān)基因已經(jīng)越來越方便，例如SSH技術(shù)、Dot-blot 技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)等。Feng等研究表明根腫病菌存在初級侵染和次級侵染2種不同的侵染機(jī)制[41]。因此，研究侵染過程各階段重要基因的功能，可為藥劑研發(fā)提供潛在的分子靶標(biāo)，為篩選新的抗源和制定新的控制策略提供重要的指導(dǎo)意義。

5.3生物防治是未來防治的一大趨勢

根腫病的防治一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，防治根腫病的措施很多，其中化學(xué)防治和種植抗病品種是防治根腫病的重要手段。但是，由于該病原菌生理小種的多樣性和易變性，導(dǎo)致抗病品種推廣數(shù)年后易失去抗性，而目前化學(xué)藥劑防效不佳，同時(shí)長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥增加了十字花科作物體內(nèi)有毒物質(zhì)的積累和殘留，給人類健康帶來危害。利用生物防治不僅避免了這一系列問題，而且安全、有效，在植物病害防治中已經(jīng)成為一種十分重要且有效的措施。然而，生物防治也有一定的局限性，如容易受到環(huán)境因素的影響，作用效果不如化學(xué)防治明顯。因此，應(yīng)不斷加深生防菌生防機(jī)制的研究，提高生防菌的生防效果和穩(wěn)定性，為生物防治帶來新的契機(jī)和應(yīng)用前景。

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