RNA測(cè)序的研究進(jìn)展

王康宇++王義++孫春玉++蔣世翠++張美萍

摘要：RNA測(cè)序研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)，能夠從整體水平研究基因功能及其結(jié)構(gòu)。隨著高通量測(cè)序和定量檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，能夠通過(guò)RNA測(cè)序?qū)D(zhuǎn)錄組進(jìn)行更深度更完整的研究。該研究進(jìn)展包括改善轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)、鏈特異性測(cè)序、融合基因的檢測(cè)、microRNA定量的分析以及RNA可變剪切的識(shí)別。目前利用單分子測(cè)序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)RNA的直接測(cè)序，通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)與單分子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方式，能更深層次、更全面地獲得轉(zhuǎn)錄組信息。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄組信息；測(cè)序；編碼RNA；非編碼RNA；高通量測(cè)序技術(shù)；單分子測(cè)序技術(shù)

中圖分類號(hào)： Q75文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0012-05

收稿日期：2013-12-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技計(jì)劃農(nóng)村領(lǐng)域項(xiàng)目（編號(hào)：2013AA102604-3）。

作者簡(jiǎn)介：王康宇（1983—），吉林通化人，博士研究生，從事植物功能基因組學(xué)研究。E-mail：wky427@sina.com。

通信作者：張美萍，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物基因組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究。E-mail：wanglaoshi0606@163.com。1995年Velculescu等首次提出了關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的概念[1]，轉(zhuǎn)錄組廣義上是指某一特定功能狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因總和，其中包括編碼RNA（mRNA）和非編碼RNA如tRNA、rRNA、snRNA、miRNA等，而非編碼RNA不能被轉(zhuǎn)錄識(shí)別，不能翻譯成蛋白質(zhì)，但是能參與某些蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程；狹義上是指所有mRNA的總和[2]。1995年第1個(gè)轉(zhuǎn)錄組是由Velculescu等在釀酒酵母細(xì)胞中獲得的，當(dāng)時(shí)的技術(shù)共獲得了60 633個(gè)轉(zhuǎn)錄本，揭示了4 665個(gè)基因，其中有1 981個(gè)基因是具有已知功能的，其他2 684個(gè)基因尚未被鑒定過(guò)[1]。從人類基因組計(jì)劃[3]的實(shí)施開(kāi)始，截至2013年10月已有68種植物和119種動(dòng)物的基因組文章相繼發(fā)表。高通量測(cè)序在過(guò)去十幾年中快速發(fā)展，促使關(guān)于生物的功能基因組研究日益興起，人們利用測(cè)序技術(shù)研究了從簡(jiǎn)單模式生物（如酵母、擬南芥、水稻等）到人等一些高等物種的基因組中DNA修飾和RNA的定性定量變化等動(dòng)態(tài)的基因組位點(diǎn)的特性。在對(duì)基因組測(cè)序和分析研究的同時(shí)，關(guān)于復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組研究也廣泛發(fā)展起來(lái)。利用高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)分析轉(zhuǎn)錄組的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，更能挖掘未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識(shí)別RNA的可變剪切以及編碼序列的單核苷酸多態(tài)性（SPN），更進(jìn)一步解析復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組信息[4]。

最初的轉(zhuǎn)錄組研究主要以基因芯片微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)，由于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)范圍取決于芯上的探針信息，所以只能檢測(cè)已知序列的特征，缺少發(fā)現(xiàn)新基因的能力，而高通量測(cè)序技術(shù)可以很好地彌補(bǔ)基因芯片技術(shù)在這方面的不足。因此，現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組的研究是借助于高通量的二代DNA測(cè)序技術(shù)（NGS）[5]來(lái)完成的，通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)并對(duì)cDNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果進(jìn)而解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的復(fù)雜變化，這使RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)基因芯片微陣列技術(shù)是極大的挑戰(zhàn)。目前，以基因測(cè)序技術(shù)為核心的新技術(shù)平臺(tái)支撐體系已經(jīng)相對(duì)成熟和完善，例如：Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)、羅氏公司的454測(cè)序技術(shù)、ABI公司的SOLID測(cè)序技術(shù)以及美國(guó)螺旋生物科學(xué)公司的新型納米孔測(cè)序技術(shù)等[5]。RNA測(cè)序技術(shù)平臺(tái)隨著NGS技術(shù)的不斷更新和提高而日益成熟完善，如測(cè)序通量、測(cè)序長(zhǎng)度、錯(cuò)配率、堿基配對(duì)讀取能力等測(cè)序性能方面技術(shù)的提高均有利于轉(zhuǎn)錄組的研究。

新RNA測(cè)序技術(shù)的不斷更新和創(chuàng)新，為人類逐步全面了解真核生物和原核生物的轉(zhuǎn)錄組信息提供了新的定性和定量的生物信息學(xué)方法。本文闡述了改善轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的映射、RNA特異鏈的測(cè)定、融合基因的檢測(cè)、小RNA定性的分析以及RNA可變剪切的識(shí)別的發(fā)展，綜述了利用單分子測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)RNA的直接測(cè)序，通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)與單分子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方式更深層次、更全面的獲得轉(zhuǎn)錄組信息，并展望了RNA測(cè)序在研究轉(zhuǎn)錄組的潛能。

1RNA測(cè)序的研究?jī)?nèi)容

1.1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）是指RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，并且能夠識(shí)別和調(diào)控每個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的啟動(dòng)子。第1個(gè)高通量獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法是帽分析基因表達(dá)法（CAGE），該方法是由最早的Sanger測(cè)序法[6]發(fā)展而來(lái)的，并能通過(guò)cDNA克隆獲得完整的RNA帽子結(jié)構(gòu)。該方法雖然對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)有效，但需要大量高質(zhì)量的RNA并且獲得的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)很短，僅是20～21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。

通過(guò)NGS技術(shù)發(fā)展，CAGE方法得到了改進(jìn)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該方法可以獲得整個(gè)基因組范圍內(nèi)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分布和獨(dú)特的啟動(dòng)子。因此，CAGE與RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合后衍生出了以CAGE策略為基礎(chǔ)的DeepCAGE法[7]、nanoCAGE法[8]、CAGEscan法[8]以及PEAT法[9]，同時(shí)以Sanger測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)的方法受到了RNA測(cè)序技術(shù)與CAGE結(jié)合的挑戰(zhàn)。例如，nanoCAGE法[8]解決了GAGE法需要大量RNA的缺點(diǎn)，可以通過(guò)放大技術(shù)從10 ng的總RNA量獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的映射；PEAT法和CAGEscan法[8-9]雙末端測(cè)序可以獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)映射以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游區(qū)間，具有良好的連通性并能促進(jìn)識(shí)別特殊的轉(zhuǎn)錄本。此外，雙末端測(cè)序緩解了對(duì)單個(gè)短讀取重復(fù)區(qū)的校對(duì)，通過(guò)RNA測(cè)序可以獲得序列的重復(fù)特性。雖然這些方法結(jié)合了NGS技術(shù)，克服了一些CAGE方法的不足，但是也存在一定的弊端。例如，在檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果過(guò)程中的操作步驟，可能影響了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率[8]；此外，在cDNA合成和測(cè)序的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，這就減少了測(cè)序的有效結(jié)果[8]。因此，這些與RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合的方法，雖然在定性檢測(cè)方面很有效，但是在定量檢測(cè)方面還需要進(jìn)一步的提高和優(yōu)化。

以RNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)研究具有依賴cDNA合成和測(cè)序技術(shù)的局限性，這個(gè)局限性主要是由RNA的結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)造成的。此外，以RNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)映射很難捕獲那些轉(zhuǎn)錄水平高且自身能夠快速降解的轉(zhuǎn)錄本，如microRNA。解決這些限制需要RNA測(cè)序技術(shù)與其他方法相結(jié)合，如以染色體為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，依賴于對(duì)組蛋白修飾后對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行有效的檢測(cè)[10-11]。轉(zhuǎn)錄后加工出現(xiàn)5′帽子結(jié)構(gòu)的RNA片段有利于被檢測(cè)[12]。因此，單單依賴于GAGE法獲得的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)具有在轉(zhuǎn)錄后加工中難分離的難題。

1.2鏈特異性測(cè)序

在關(guān)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，物種中普遍存在反義轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。反義轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)功能明晰，它能在生物體正常生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下發(fā)揮各種作用[13]。因此，在更深層次研究轉(zhuǎn)錄組時(shí)，對(duì)正義鏈和反義鏈的測(cè)序和分析研究成為了一個(gè)重點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的RNA測(cè)序方法一般需要合成雙鏈的cDNA，這樣會(huì)丟失RNA鏈的部分信息。此外，在cDNA第1條鏈合成后需要依賴DNA聚合酶（DDDP）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA的第2條鏈，此過(guò)程會(huì)引入虛假的信息[14-15]，這能混淆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)的分辨率。作為抑制反轉(zhuǎn)錄酶DDDP活性的物質(zhì)，放線菌素D的有效抑制作用尚未被報(bào)道[16]。為克服這些難題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了鏈特異性RNA測(cè)序的分析策略。

對(duì)特異鏈信息的獲得依賴于3種方式：第1種方法是在RNA尾部或cDNA第1條鏈預(yù)定方向連上接頭，已知方向上的接頭被作為獲取RNA鏈信息的參考點(diǎn)；第2種方法是直接對(duì)cDNA的第1條鏈進(jìn)行測(cè)序；第3種方法是在合成的cDNA第2條鏈或RNA上進(jìn)行選擇性標(biāo)記。這些方法可以讓大家更了解反義轉(zhuǎn)錄過(guò)程，包括反義RNA轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)圖譜的建立如核糖體轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)和識(shí)別新的反義轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。以釀酒酵母的基因組作為參考，比較這3種方法[17]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)于鏈特異性水平、平均覆蓋率、注釋信息、建庫(kù)復(fù)雜性以及定量表達(dá)譜分析等具有差異。關(guān)于外界添加酶的添加對(duì)這些數(shù)據(jù)造成的特異性偏差依然缺乏更深入的研究，這些數(shù)據(jù)合理處理的問(wèn)題也成為日后研究的重點(diǎn)。

首先，逆轉(zhuǎn)錄酶在合成cDNA的第1條鏈并轉(zhuǎn)錄形成 cDNA 第2條鏈時(shí)具有傾向性，目前尚不明晰這個(gè)依賴于 cDNA 第1條鏈測(cè)序的方法是否完全具有單鏈的特異性[15-16]。這些方法通過(guò)對(duì)單鏈特異性進(jìn)行比較分析獲得已知反義鏈的方向、基因注釋以及相對(duì)讀取位置。有研究表明，小部分的讀取方向是反義方向，所以這些鏈可能不完全具有單鏈特異性。此外，cDNA第1條、第2條鏈不能恰當(dāng)?shù)貙?duì)參考序列進(jìn)行定位[17]。對(duì)基因組正義和反義的轉(zhuǎn)錄給出了不完全的注釋，即使在釀酒酵母這樣模式物種中，這些方法也不能完全確定鏈的特異性。

其次，添加接頭的方法具有序列的偏好。依賴于接頭的方法會(huì)存在不同表現(xiàn)性的偏差，這種偏差存在于轉(zhuǎn)錄組分析和核糖體分析中[18-19]。與使用3′端多聚腺嘌呤酶的獲得的文庫(kù)相比使用接頭獲得的文庫(kù)存在覆蓋率不均勻的現(xiàn)象[20]。

最后，其中一些方法包含使用溶液或者添加步驟都會(huì)添加外來(lái)物如DNA聚合酶的使用，例如，對(duì)GC形式的偏差和重復(fù)形式的讀取。RNA模板對(duì)GC形式的存在有一定的偏差，所以應(yīng)該擁有中度的GC含量[21]。而對(duì)重復(fù)序列的讀取是特異鏈RNA測(cè)序主要解決的問(wèn)題，這些影響因素能通過(guò)鏈特異性RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展或已有測(cè)序技術(shù)的改變和提高得到解決。

1.3可變剪接的識(shí)別

目前，已知15%～60%的突變來(lái)源于RNA可變剪接，完整的RNA可變剪接事件是分析和了解細(xì)胞分化和疾病發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)[22]?？勺兗艚佑?種基本形式，即內(nèi)含子保留、可變的5′端、可變的3′端、外顯子盒、互斥外顯子、可變的起始或末端外顯子（這2種形式更有可能是可變啟動(dòng)子、可變polyA位點(diǎn)造成的）。因此，可變剪切事件的識(shí)別在RNA測(cè)序中具有重要性。最早利用RNA測(cè)序方法對(duì)可變剪切位點(diǎn)識(shí)別的研究受測(cè)序讀取長(zhǎng)度的限制，因此最初的RNA測(cè)序?qū)勺兗艚拥难芯客ㄟ^(guò)使用計(jì)算機(jī)來(lái)彌補(bǔ)這一限制。在人的基因組中超過(guò)95%的外顯子基因具有可變剪切的發(fā)生，每個(gè)組織中含有110 000個(gè)新型剪接位點(diǎn)，可變剪切事件改變了對(duì)人類基因組的組裝，從而獲得了人的基因，數(shù)量為35 000[23]。通過(guò)計(jì)算每個(gè)外顯子讀取基因的數(shù)量和每個(gè)剪接點(diǎn)的生成，決定每個(gè)接點(diǎn)剪接效率和不同種類亞型的水平[24]。

通過(guò)改進(jìn)目前的RNA測(cè)序技術(shù)來(lái)增加讀取的長(zhǎng)度，能更好地映射到具有可變剪切的外顯子上。通過(guò)改進(jìn)測(cè)序技術(shù)能提高讀取區(qū)的分塊[25]，調(diào)整定位基因組每個(gè)獨(dú)立的區(qū)塊。此外，通過(guò)改進(jìn)雙末端測(cè)序方法能從轉(zhuǎn)錄本的預(yù)計(jì)讀取間距離2點(diǎn)上獲得更多的測(cè)序信息?，F(xiàn)在在不需要先前已知轉(zhuǎn)錄信息的基礎(chǔ)上就能識(shí)別可變剪接事件的發(fā)生，識(shí)別可變剪接、轉(zhuǎn)錄本連通性以及基因組組裝方式需要獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列，這些在未來(lái)可能產(chǎn)生新興技術(shù)。

1.4基因融合檢測(cè)

基因融合技術(shù)是將不同的基因連接起來(lái)，從而表達(dá)具有復(fù)合功能的融合蛋白，融合蛋白除了具有衍生因子的雙重活性外，還具有融合蛋白的活性高于衍生因子相加的活性。RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析不僅可以對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，還可以用來(lái)檢測(cè)有組織細(xì)胞中的基因融合現(xiàn)象，其中用于生物醫(yī)學(xué)方面的研究尤為重要。利用單端測(cè)序和雙末端測(cè)序相結(jié)合的策略更易檢測(cè)到基因組DNA的易位和基因組重排現(xiàn)象[26]。然而，RNA測(cè)序技術(shù)能夠更好地識(shí)別物種中產(chǎn)生異常變化的RNA種類，使檢測(cè)因功能性或互作關(guān)系引起物種基因融合導(dǎo)致病變的研究具有可能性。此外，以基因組DNA為基礎(chǔ)方法不能識(shí)別基因融合是由于非基因組因素影響，如轉(zhuǎn)移剪接或者相鄰轉(zhuǎn)錄本間通讀所引起的融合現(xiàn)象[26]。雙末端配對(duì)的RNA測(cè)序能夠提高基因覆蓋率，因此對(duì)檢測(cè)基因融合具有特別的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在該方法被用于病理學(xué)的研究，并為調(diào)控與治療提供潛在的可能性。

對(duì)基因融合檢測(cè)所面臨的最大難題是與之并行存在的RNA可變剪接。此外，RNA測(cè)序分析不能檢測(cè)包括擁有編碼序列的其他基因的啟動(dòng)子融合現(xiàn)象，同時(shí)在RNA測(cè)序時(shí)含有嵌合有外界添加制品的cDNA測(cè)序模板也可能導(dǎo)致基因融合識(shí)別中假陽(yáng)性的出現(xiàn)[27]。但是，通過(guò)增加足夠RNA測(cè)序的測(cè)序通量和測(cè)序讀取片段長(zhǎng)度等技術(shù)的改進(jìn)，可能會(huì)降低檢測(cè)基因融合過(guò)程中假陽(yáng)性的產(chǎn)生[5]。

1.5microRNA定量分析

NGS技術(shù)對(duì)sRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定的影響特別明顯。對(duì)miRNA的研究已經(jīng)成為目前世界上RNA測(cè)序技術(shù)研究的熱點(diǎn)，miRNA最初的發(fā)現(xiàn)和研究是通過(guò)焦磷酸測(cè)序進(jìn)行的[28]，后來(lái)隨著高通量NGS平臺(tái)的使用，大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)并引起了研究的重視。但NGS樣品的準(zhǔn)備需要更長(zhǎng)的RNA（>200個(gè)核苷酸），因此二代測(cè)序?qū)iRNA研究不合適[29]。可見(jiàn)反轉(zhuǎn)錄和隨機(jī)引物測(cè)序的策略，為其提供了解決問(wèn)題的新途徑。

目前，研究miRNA的RNA測(cè)序方法的一個(gè)重要問(wèn)題是miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，關(guān)于 miRNA 的研究思路逐漸變得清晰，通過(guò)以NGS為基礎(chǔ)的 miRNA 定量分析可以通過(guò)差異表達(dá)分析完成，但是還存在如何獲得每個(gè)miRNA的讀取數(shù)量不是找出其實(shí)際表達(dá)豐度的有效辦法[30]，這些差異更有可能是由在樣品準(zhǔn)備和測(cè)序時(shí)的偏差所造成的。所以，新興技術(shù)能否提高sRNA定量測(cè)定與分析讓人拭目以待。

綜上所述，高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展使得測(cè)序量和成本逐漸降低，但是還存在如何獲得足夠通量的測(cè)序覆蓋度和其他一些潛在的問(wèn)題。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，等位基因在表達(dá)上存在差異，導(dǎo)致低豐度轉(zhuǎn)錄組本與基因型的測(cè)定和分析很難完成，這就要求獲得轉(zhuǎn)錄過(guò)程越豐富越好，優(yōu)選優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以盡量減少測(cè)序的總成本并使分析樣品數(shù)最大化。

2單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA的直接測(cè)序

2.1RNA測(cè)序的影響因素

目前，cDNA的合成和其他RNA操作極大地限制了RNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用?，F(xiàn)今許多RNA測(cè)序方法依賴于cDNA的合成和以及一系列的合成后續(xù)操作步驟，這使得RNA測(cè)序的應(yīng)用具有一定的局限性。例如，人工條件下合成的cDNA第2條鏈在特異鏈RNA測(cè)序時(shí)相當(dāng)困難。為了在特異鏈建庫(kù)時(shí)避免這一問(wèn)題，使用RNA-RNA連接和建庫(kù)的方法費(fèi)力且難構(gòu)建，因此可以通過(guò)合成cDNA作為模版來(lái)突破這個(gè)限制[31]。在反轉(zhuǎn)錄時(shí)，合成初期的cDNA有時(shí)會(huì)從RNA中分離出來(lái)，通過(guò)再退火與RNA序列特異性結(jié)合到初始模板上并進(jìn)行延伸，會(huì)人工產(chǎn)生嵌合的cDNA。通過(guò)模板切換能解決在外顯子-內(nèi)含子界限的識(shí)別和嵌合轉(zhuǎn)錄上所產(chǎn)生的問(wèn)題。同時(shí)，反轉(zhuǎn)錄酶在無(wú)引物條件下由于RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)也能自由合成cDNA，這將導(dǎo)致隨機(jī)的cDNA被合成[32]，這是由于反轉(zhuǎn)錄酶與其他酶相比保真度低，缺乏校正機(jī)制[32]。所以，在RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA時(shí)轉(zhuǎn)化效率受試驗(yàn)條件影響。

RNA測(cè)序技術(shù)除了cDNA影響因素外，還有其他影響因素。第一，RNA測(cè)序信號(hào)具有不均勻覆蓋性，這就可能在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中因一些因素的影響產(chǎn)生偏差[33]，如隨機(jī)引物選擇、cDNA合成以及連接等。第二，使用統(tǒng)一的RNA測(cè)序策略，導(dǎo)致在RNA或cDNA讀取長(zhǎng)度選擇的不合理，以致轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度存在偏差，給下游分析造成了嚴(yán)重結(jié)果。第三，RNA測(cè)序定量分析需要考慮到不確定的讀段長(zhǎng)度和每個(gè)轉(zhuǎn)錄本讀段正常化[34]。盡管隨著轉(zhuǎn)錄方法的提高和生物信息學(xué)的發(fā)展允許轉(zhuǎn)錄組從頭合成測(cè)序，但存在的方法通常難以檢測(cè)確定的轉(zhuǎn)錄以及其覆蓋全部長(zhǎng)度。因RNA存在可變剪切，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄邊界和長(zhǎng)度存在不確定性，正常長(zhǎng)度是RNA測(cè)序定量分析的潛在錯(cuò)誤源。第四，RNA測(cè)序策略往往涉及到mRNA的富集，因此利用RNA轉(zhuǎn)錄聚合酶Ⅰ對(duì)mRNA的polyA進(jìn)行富集可以獲得理想的RNA產(chǎn)物。

2.2單分子測(cè)序的研究進(jìn)展

目前，RNA測(cè)序和分析技術(shù)發(fā)展受到諸多條件的限制，單分子測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)解決了現(xiàn)階段二代測(cè)序技術(shù)解決不了的問(wèn)題，因?yàn)閱畏肿訙y(cè)序技術(shù)可以不經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，不改變RNA的原本特性，直接對(duì)RNA分子進(jìn)行測(cè)序。但是單分子測(cè)序也有其不足之處，使得RNA直接測(cè)序技術(shù)發(fā)展前景充滿了未知。

二代高通量測(cè)序的讀取序列片段太短，使得后續(xù)的組裝工作困難且繁瑣。而三代高通量測(cè)序采用的是單分子測(cè)序原理，不僅可以降低測(cè)序每個(gè)堿基的費(fèi)用，簡(jiǎn)化測(cè)序樣品的制備流程，加快測(cè)序速度，縮短分析數(shù)據(jù)的過(guò)程，而且還具有讀取數(shù)百個(gè)堿基甚至更長(zhǎng)片段的優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用在從頭測(cè)序時(shí)使數(shù)據(jù)分析過(guò)程簡(jiǎn)化了[35]。這種長(zhǎng)片段的測(cè)序技術(shù)與短片段測(cè)序相比在后續(xù)組裝中得到了簡(jiǎn)化，因而省去了不必要的麻煩，同時(shí)還增加了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的新內(nèi)容，如拷貝數(shù)變異情況、可變剪切識(shí)別、轉(zhuǎn)位情況、嵌合轉(zhuǎn)錄本識(shí)別以及基因型分期等。

RNA直接技術(shù)是隨著Helicos公司的Heliscope并行單分子測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來(lái)的?，F(xiàn)階段主要的單分子測(cè)序技術(shù)分為Helicos公司的Heliscope并行單分子合成測(cè)序技術(shù)、Pacific公司的SMRT單分子實(shí)時(shí)合成測(cè)序技術(shù)以及Oxford Nanopore公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。單分子測(cè)序技術(shù)具有二代測(cè)序技術(shù)不具備的優(yōu)點(diǎn)，如不在需要制備測(cè)序所用的DNA文庫(kù)可以對(duì)樣品片段直接進(jìn)行單分子擴(kuò)增、測(cè)序的速度更快、測(cè)序過(guò)程具有并行度以及讀取長(zhǎng)度更長(zhǎng)等。

Heliscope并行單分子合成測(cè)序技術(shù)的原理是該技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)的RNA樣品連接上已知序列的接頭[通常為poly（A）]并于單通道與含有poly（T）的共價(jià)引物進(jìn)行雜交，再用過(guò)精準(zhǔn)定位的成像系統(tǒng)鑒定具有標(biāo)記的測(cè)序片段，其具有以下特點(diǎn)：第一，測(cè)序可以不是同步的，可以同時(shí)讀取不同長(zhǎng)度的片段，這就改善了二代測(cè)序讀取長(zhǎng)度均一的策略，讀取長(zhǎng)度不均一的測(cè)序模板可造成測(cè)序速度快慢不等。第二，在熒光標(biāo)記的核苷酸上沒(méi)有終止基團(tuán)。在二代測(cè)序時(shí)，測(cè)序模板存在同聚物時(shí)帶有熒光標(biāo)記的堿基之間與同聚物結(jié)合會(huì)發(fā)生猝滅的現(xiàn)象，這樣就無(wú)法識(shí)別讀取的堿基數(shù)，而Heliscope單分子測(cè)序技術(shù)能記錄所讀取的每個(gè)堿基數(shù)據(jù)，這樣就避免了猝滅現(xiàn)象的發(fā)生。第三，可以通過(guò)2步測(cè)序（正向測(cè)序和反向測(cè)序）提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。第四，測(cè)序過(guò)程中會(huì)有未標(biāo)記的堿基、不發(fā)熒光的堿基以及污染堿基的混入，會(huì)使測(cè)定缺失突變時(shí)的錯(cuò)誤率較高，2步測(cè)序2次誤差率分別為2%～7%、0.2%～1.0%，但是在測(cè)定堿基替換突變時(shí)的錯(cuò)誤率非常低，2步測(cè)序2次錯(cuò)誤率分別在0.01%～100%、0001%，這是目前測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確率最高的[36]。

SMRT單分子實(shí)時(shí)合成測(cè)序技術(shù)的原理同樣也是基于邊合成邊測(cè)序的思路，該技術(shù)以SMRT芯片作為測(cè)序載體進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有需要零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMW）的且孔的厚度為100 nm的金屬片。將DNA聚合酶、測(cè)序模板以及帶有不同熒光標(biāo)記的dNTP加入到ZMW孔中，進(jìn)行邊合成邊測(cè)序反應(yīng)[37]。dNTP的磷酸基團(tuán)被熒光標(biāo)記，當(dāng)dNTP被添加到合成鏈上時(shí)，進(jìn)入ZMW孔的激光束會(huì)激發(fā)熒光，根據(jù)不同的熒光成像就能獲得測(cè)序結(jié)果；而添加到合成鏈上的dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被剪切并釋放，這樣不再具有熒光標(biāo)記，便不會(huì)再被識(shí)別。因此，SMRT單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的測(cè)序速度很快，其測(cè)定堿基的速度可以達(dá)到10個(gè)/s[38]，測(cè)序過(guò)程中對(duì)每條堿基鏈的數(shù)據(jù)都會(huì)進(jìn)行評(píng)估，更易發(fā)現(xiàn)稀有變異；具有超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)度，即平均讀長(zhǎng)度超過(guò)1 000 bp甚至更長(zhǎng)等。但是，也存在缺陷，如不能高效利用DNA聚合酶且容易在ZMW中降解失活、總體上每個(gè)堿基測(cè)序成本高、機(jī)器相當(dāng)?shù)陌嘿F等。

納米孔單分子測(cè)序技術(shù)的原理與前兩者不同，采樣的是電信號(hào)測(cè)序技術(shù)，通過(guò)借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序[39]。納米孔的直徑非常小，僅允許單個(gè)核苷酸通過(guò)，因此可用于高通量測(cè)序。此外，納米級(jí)別的孔徑保證了測(cè)序過(guò)程中良好的檢測(cè)過(guò)程，使測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性非常高。RNA測(cè)序時(shí)省略的擴(kuò)增階段和標(biāo)記手段可直接測(cè)序，使簡(jiǎn)便快捷的測(cè)序過(guò)程更可能成為現(xiàn)實(shí)。雖然納米孔單分子測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序成本很低和測(cè)序長(zhǎng)度很長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，但是在如何控制納米孔徑、如何通過(guò)納米孔徑控制速度以及納米孔材料和制造等問(wèn)題是該技術(shù)面臨的最大問(wèn)題。納米孔徑過(guò)大會(huì)造成一次性通過(guò)的核苷酸過(guò)多，過(guò)小會(huì)造成單個(gè)核苷酸無(wú)法通過(guò)；通過(guò)納米孔徑的速度會(huì)影響測(cè)序速度，通過(guò)速度過(guò)慢不能實(shí)現(xiàn)快速高通量測(cè)序，而通過(guò)過(guò)快也不能確保識(shí)別信號(hào)的穩(wěn)定性；納米孔制作的材料要求高，制造起來(lái)極其費(fèi)時(shí)且其價(jià)格很貴。這些因素影響了該技術(shù)發(fā)展的腳步，解決這些問(wèn)題對(duì)直接測(cè)序技術(shù)具有里程碑的意義。

總之，單分子測(cè)序技術(shù)是RNA直接測(cè)序的主要技術(shù)支持。單分子測(cè)序技術(shù)在測(cè)序成本、錯(cuò)配率、讀取長(zhǎng)度以及測(cè)序通量等技術(shù)指標(biāo)上比二代測(cè)序技術(shù)有了更大的改進(jìn)和提高。用于RNA測(cè)序時(shí)也解決了反轉(zhuǎn)錄成cDNA以及RNA含量低和長(zhǎng)短不均一等造成無(wú)法測(cè)序的問(wèn)題，通過(guò)簡(jiǎn)化測(cè)序步驟和對(duì)測(cè)序樣品不需要預(yù)處理就使得RNA直接測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)。但是單分子測(cè)序技術(shù)還存在著不足，所以利用二代測(cè)序技術(shù)和單分子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的方法可以解決目前研究中存在的不少問(wèn)題，如SNP位點(diǎn)識(shí)別、基因缺失研究以及基因拷貝數(shù)的變異分析等。

3展望

測(cè)序技術(shù)從Sanger測(cè)序技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)階段的單分子測(cè)序技術(shù)，在這個(gè)過(guò)程中RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展還在繼續(xù)，并且朝著更快速、更靈敏、更精準(zhǔn)、更廉價(jià)的方向發(fā)展。RNA測(cè)序研究是基因功能研究及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)，能夠從整體水平上研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。單分子測(cè)序技術(shù)推動(dòng)RNA測(cè)序技術(shù)更進(jìn)一步發(fā)展，RNA直接測(cè)序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)逐步替代基因芯片微陣列技術(shù)成為現(xiàn)在功能基因組學(xué)研究基因表達(dá)的主流方式。

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