江蘇安徽地區(qū)鵝源沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

査 華，石火英，尚 竟，晉海云，劉 伊，王 婉

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理教研室禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

沙門菌是一種對(duì)人和動(dòng)物都非常重要的致病菌，它不但可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥和腸炎，還可以作為食源性疾病的病原體，引起人類胃腸炎和食物中毒[1,2]。禽源沙門菌是嚴(yán)重危害我國(guó)禽業(yè)的重要傳染病，可造成種蛋孵化率、雛禽存活率和禽生產(chǎn)性能下降等問題[3]。雞白痢沙門菌是禽源沙門菌中的一種，在各種年齡雞只都可發(fā)病?？股厥欠乐坞u白痢重要措施，但抗生素的濫用造成了雞白痢沙門菌的耐藥性逐年上升[4-,5]。雖有文獻(xiàn)報(bào)道鵝源沙門菌診斷和防治，但針對(duì)鵝源沙門菌的實(shí)驗(yàn)室診斷、分型和耐藥性分析卻較為罕見[6]。本研究對(duì)2012年6月-2013年1月江蘇、安徽地區(qū)的532份鵝源病料、泄殖腔棉拭子進(jìn)行了沙門菌的分離，并對(duì)鑒定出的15株鵝源沙門菌進(jìn)行血清型分型及藥物敏感性試驗(yàn)，以期對(duì)鵝源沙門菌新近分離株的流行分布及耐藥性提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院來源的江蘇、安徽地區(qū)鵝源病料，匯集江蘇、安徽地區(qū)鵝的揚(yáng)州市活禽市場(chǎng)所采集的鵝泄殖腔棉拭子。

1.2 質(zhì)控菌株及主要試劑 藥敏試驗(yàn)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922，由實(shí)驗(yàn)室保存。沙門菌屬診斷血清(60種)，購自蘭州生物制品研究所；PCR相關(guān)試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，麥康凱培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基（沙門、志賀氏菌屬瓊脂培養(yǎng)基），購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管及成套試劑，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 藥敏紙片 頭孢曲松（30μg），四環(huán)素（30 μg），壯觀霉素（100μg），頭孢西?。?0μg），鏈霉素（10μg），氯霉素（30μg），頭孢孟多（30μg），卡那霉素（30μg），復(fù)方新諾明（23.75μg），磺胺異噁唑（300μg），羧芐青霉素（100μg），慶大霉素（10 μg），甲氧芐啶（5μg），萘啶酸（30μg），氨芐西林（10μg），頭孢噻肟（30μg），環(huán)丙沙星（5μg），阿莫西林-克拉維酸（20μg）等18種藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 細(xì)菌分離、純化及革蘭染色 以常規(guī)無菌操作方法剖檢病死雞，取病料、泄殖腔樣品置于SC肉湯中，37℃搖床增菌18～24 h；轉(zhuǎn)接于麥康凱培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～48 h，挑取可疑菌落于S.S.及麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化。將純化菌直接涂片，按革蘭染色程序（草酸銨結(jié)晶紫液1 min，碘液1min，95%酒精15～30 s，沙黃復(fù)染液1 min）操作后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5 PCR鑒定沙門菌屬 針對(duì)沙門菌腸毒素STN基因設(shè)計(jì)引物，上游引物 P1：5′-CTTTGGTCGTA?AAATAAGGCG-3′，下游引物P2：5′-TGCCCAAAG CAGAGAGATTC-3′[7]。PCR體系為25 μL，模板為純化后的疑似沙門菌單菌落提取的DNA。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 生化試驗(yàn)鑒定沙門菌 PCR鑒定為陽性的分離株，進(jìn)行硫化氫、苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖等15種生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.7 血清學(xué)分型 對(duì)STN基因擴(kuò)增為陽性、生化試驗(yàn)符合沙門菌特性的分離株，再次純化，涂布于LB培養(yǎng)基，按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4 789.4～2010，進(jìn)行血清型鑒定[8]。

O抗原鑒定：用A-F多價(jià)O血清進(jìn)行玻板凝集實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)以生理鹽水對(duì)照。生理鹽水不凝集而O多價(jià)血清凝集者，用O9；O4；O10；O7；O8；O2和O11因子血清做凝集試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判定O群。

H抗原鑒定：生理鹽水對(duì)照為陰性者，進(jìn)行H多價(jià)1、H多價(jià)2、H多價(jià)3、H多價(jià)4血清進(jìn)行鑒定，對(duì)于陽性者，再用對(duì)應(yīng)的H復(fù)合血清及H單因子血清逐一檢查，以確定H第一相及第二相H抗原。每一個(gè)H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個(gè)H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)。

1.8 藥物敏感性試驗(yàn) 對(duì)鑒定出的鵝源沙門菌分離株，通過瓊脂紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer,K-B)進(jìn)行頭孢曲松、四環(huán)素、壯觀霉素、頭孢西丁等18種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，按CLSI2009版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定[9]。

1.9 動(dòng)物試驗(yàn) 篩選2株所分離沙門菌優(yōu)勢(shì)菌（雞白痢沙門菌）S1084和S1088，對(duì)1日齡SPF雛雞進(jìn)行致死性試驗(yàn)，腹腔注射200μL/只（約含菌量1×109CFU），每組10只，并設(shè)置陰性對(duì)照組，注射后觀察2周，記錄死亡情況，并剖檢死亡雞只，取肝、脾在麥康凱培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離，37℃培養(yǎng)18～48 h，觀察菌落形態(tài)并用O9單因子血清進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌培養(yǎng)特性與形態(tài)特征 病料接種后，可見在麥康凱培養(yǎng)基均形成無色、半透明、邊緣整齊、光滑型圓形小菌落；在S.S.培養(yǎng)基形成白色或中心帶黑色的邊緣整齊、光滑、圓形小菌落；革蘭染色鏡檢可觀察到散在排列的紅色短小桿菌，符合沙門菌的特征。

2.2 PCR鑒定結(jié)果 在初步分離的疑似沙門菌中，采用針對(duì)沙門菌腸毒素STN基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中有15個(gè)分離株基因組DNA中能夠擴(kuò)增出約260 bp DNA片段，與沙門菌預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果一致，表明所分離菌中有15株為沙門菌。

2.3 生化試驗(yàn) 分離株能產(chǎn)生硫化氫，利用木糖、鳥氨酸、賴氨酸、M.R.、葡萄糖產(chǎn)氣、山梨醇，而其余指標(biāo)如V-P、動(dòng)力、側(cè)金盞花醇等為陰性。

2.4 血清型鑒定 經(jīng)血清型鑒定，所分離15株沙門菌中，10株為雞白痢沙門菌，2株為德爾卑沙門菌，1株為湯卜遜沙門菌，1株為鼠傷寒沙門菌，1株為里吉爾沙門菌。沙門菌分布情況如表1。

表1 鵝源沙門菌分離株的分布情況

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 所鑒定15個(gè)鵝源沙門菌分離株的18種抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株對(duì)萘啶酸全部耐藥，對(duì)羧芐青霉素、氨芐西林、鏈霉素和磺胺異噁唑也具有很高的耐藥性，耐藥率分別為93.33%、86.67%、80%和80%；而對(duì)頭孢曲松、頭孢西丁和卡那霉素耐藥性較低，各抗菌藥物分布菌數(shù)及所占比例見表2。除個(gè)別分離株耐藥性較低外，86.67%的分離株為多重耐藥菌，且多為7耐菌和8耐菌，表型為TETSTR-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX和STR-CE-SULCAR-NAL-AMP-AMX，8耐分離株表型分別為TET-STR-CE-SUL-CAR-NAL-AMP-AMX、SPTSTR-SXT-SUL-CAR-TMP-NAL-AMP和STR-CECAR-TMP-NAL-AMP-CTX-AMX；甚至出現(xiàn)14耐和15耐的高度耐藥菌，分離株表型見表3。

2.6 致死性試驗(yàn)結(jié)果 1日齡雛雞接種S1084和S1088后24 h內(nèi)即出現(xiàn)死亡，其余死亡雞分布在攻毒后6 d內(nèi)，而在7～14 d期間未見雞死亡，所攻毒雞的死亡總數(shù)分別為10只和8只，陰性對(duì)照組雞生長(zhǎng)健康。剖檢死亡雛雞，并進(jìn)行肝和脾的沙門菌分離，在麥康凱和S.S.培養(yǎng)基所培養(yǎng)細(xì)菌均符合沙門菌菌落形態(tài)，O9血清鑒定純化后細(xì)菌，都為強(qiáng)陽性凝集，且健康組雞肝、脾內(nèi)未分離到細(xì)菌，表明攻毒組確為雞白痢沙門菌感染，進(jìn)而說明鵝源雞白痢沙門菌對(duì)雛雞具有很高的致病性。

表2 鵝源沙門菌抗菌藥物分布菌數(shù)及所占比例統(tǒng)計(jì)

表3 鵝源沙門菌的耐藥表型

3 討論

禽源沙門菌是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病病原，給家禽養(yǎng)殖和蛋類生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前沙門菌防治以抗生素治療和生物防控為主，但部分地區(qū)抗生素的濫用也造成了禽源沙門菌耐藥性的上升。近年來，有報(bào)道沙門菌的流行病學(xué)和耐藥監(jiān)測(cè)，但針對(duì)鵝源沙門菌的流行、亞型分布和耐藥監(jiān)測(cè)卻比較少見[6,10]。本研究通過分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)方法結(jié)合，對(duì)鵝源病料、棉拭子進(jìn)行沙門菌的分離鑒定和多重耐藥性分析，共鑒定新近鵝源沙門菌15株，陽性率為2.82%，分布于B群、C1群和D群，其中雞白痢沙門菌占多數(shù)（66.67%）。藥敏結(jié)果顯示，分離株對(duì)萘啶酸全部耐藥，對(duì)羧芐青霉素、氨芐西林、鏈霉素和磺胺異噁唑耐藥性也很強(qiáng)，由于動(dòng)物源的沙門菌耐藥機(jī)制將會(huì)影響人類健康，因此，獸醫(yī)臨床工作者應(yīng)控制抗菌藥物的使用和用量。在全部鵝源沙門菌中，86.67%的分離株為多重耐藥性菌，且耐藥性很強(qiáng)，甚至出現(xiàn)15耐的罕見多重耐藥菌（為德爾卑沙門菌）。值得注意的是，所有鵝源雞白痢沙門菌耐藥性在7耐及7耐以上，其水平傳播很可能使雞具有很高的耐藥性和致病性，既而對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的雛雞繁殖和蛋類生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，故建議進(jìn)行雞和鵝的分群飼養(yǎng)，并對(duì)鵝源雞白痢沙門菌進(jìn)行長(zhǎng)期的耐藥監(jiān)測(cè)。

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