Gh relin對豬小腸上皮細胞增殖的影響

孔志偉，姜明鑫，郭 楠 ，楊文艷 ，楊連玉

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林 長春 130118）

Ghrelin[1]是近年來新發(fā)現(xiàn)的由28個氨基酸組成的內(nèi)源性肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一的生長激素促分泌激素受體（growth hormonesecretagogues receptor，GHSR）的天然配體。Ghrelin與其配體結(jié)合不僅能夠促進垂體在體內(nèi)和體外分泌生長激素[1-2]，而且還與采食行為以及能量代謝的平衡有關(guān)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)，外源性的Ghrelin能夠提高小腸內(nèi)外源性Ghrelin基因的表達。15μg/kg的胃內(nèi)Ghrelin能夠顯著增強小腸內(nèi)細胞的增值率，降低細胞凋亡率[8]，并且有研究顯示結(jié)果與這一說法相一致[9-13]。小腸是食物進行消化、吸收的主要場所，研究Ghrelin對小腸上皮細胞生長發(fā)育的影響能夠進一步了解Ghrelin代謝的過程。該試驗通過體外培養(yǎng)的方法，對添加不同濃度梯度的Ghrelin對小腸上皮細胞的增殖情況進行分析，從而了解Ghrelin對豬小腸上皮細胞增殖的作用，為深入的研究Ghrelin對小腸上皮細胞影響的機制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 分光光度計 (BIO RAD680，美國)；二氧化碳培養(yǎng)箱（SELECTA，西班牙）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；高壓蒸汽滅菌鍋（SAN?YO，日本）；超凈工作臺（SANYO，日本）；水平搖床(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司HZS-H)；鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.2 試驗試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（GIBCO），胎牛血清（PAA），谷氨酰胺和胰蛋白酶均為AMRESCO產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素均為Sigma產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶，膠原酶Ⅳ，MTT（Sigma）,二甲基亞砜（Sig?ma），Ghrelin（北京拜威佑生養(yǎng)殖管理咨詢機構(gòu)）。

1.3 細胞來源 試驗所用細胞來自于動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室（吉林農(nóng)業(yè)大學）。

1.4 試驗方法

1.4.1 條件培養(yǎng)液的配制 配制Ph=6.4的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，然后將Ghrelin溶解其中配制成3×10-5mol/L的濃縮液，上述操作遵照Ghrelin說明書。用10%DMEM-F12溶液稀釋上述濃縮液為1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L各10mL。保存在4℃冰箱中備用。

1.4.2 Ghrelin的添加 將傳5代體外培養(yǎng)的小腸上皮細胞用0.25%胰酶消化，然后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成細胞懸液，接種于6個96孔板中，每孔200 μL，細胞濃度為2×104，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后取出一板，檢測細胞同步化情況。共兩個處理組：Ghrelin組和對照組。Ghrelin組加入終濃度為1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L、1×10-9mol/L、1×10-10mol/L的Ghrelin液，對照組僅有等量細胞液。各孔均補足培養(yǎng)液至200μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分別于第1、3、5、7、9天各取出一板，于孔板內(nèi)加入MTT 20μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，后取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 50μL，在空白孔中加入DMSO 50μL作為空白對照，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用分光光度計，選擇490 nm波長，測定各孔的吸光值，記錄結(jié)果，繪制細胞生長曲線。

2 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和用LSD法進行兩因素多水平間的多重比較，數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。

3 結(jié)果

Ghrelin對豬小腸上皮細胞增殖的影響 試驗組1×10-7mol/L濃度時在1～3 d時增殖較快（P＜0.01），刺激后第5天達到增值高峰（P＜0.05），1×10-6mol/L濃度時在3～5 d時增殖較快，其余各濃度組對豬小腸上皮細胞的增殖既無明顯促進作用，也無明顯抑制作用（見表1）。

表1 Ghrelin不同濃度處理組的細胞活性

圖1 刺激后各濃度組細胞生長曲線

4 討論

在人和鼠，Ghrelin的表達以胃組織中為最多，另在下丘腦、小腸、大腸、胰腺和胎盤等也有表達[14]。體外培養(yǎng)條件下,人和鼠Ghrelin均可直接刺激GH在豬垂體前葉細胞的釋放[15]。研究Ghrelin的分泌規(guī)律及其作用機制，對于研究豬的生長調(diào)控等有著重要的作用。該試驗在體外培養(yǎng)的條件下以傳代培養(yǎng)的豬小腸上皮細胞（車東升等，2010[16]）為材料。參照苗艷穎等(2005)[17]、何紅晨等(2006)[18]研究設(shè)計Ghrelin添加水平。該試驗結(jié)果顯示，在添加不同濃度Ghrelin時，1×10-6mol/L-1×10-7mol/L組的增殖效果顯著（P＜0.05），細胞的數(shù)量也是最多，并且在第5天時達到增值高峰。而以往的研究顯示，10-7～10-15mol/LGhrelin作用24 h能夠明顯促進前脂肪細胞的增殖[19]；10-7mol/LGhrelin能夠顯著促進胰島素β細胞的增殖[20]，10-10mol/LGhrelin能夠極顯著的促進人成骨細胞的增殖[18]。Ghrelin對小腸的作用或許是由于外源性的Ghrelin促進了腸內(nèi)Ghrelin的表達，從而調(diào)節(jié)生長激素的分泌，進而促進小腸上皮細胞的增殖；也或許是Ghrelin受體基因mRNA的表達增多，與外源性的Ghrelin作用，對小腸作用的Ghrelin量增多，間接的引起生長激素的分泌，引起腸上皮細胞的增殖；還可能是通過內(nèi)分泌或者是旁分泌的形式作用于生長激素釋放激素受體，從而促進小腸上皮細胞的增殖。近年來，對Ghrelin的研究逐漸增多，但是對于Ghrelin的分泌調(diào)節(jié)機制仍不清楚。

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