江蘇人群MICA 基因多態(tài)性與乙型肝炎源性肝癌的相關(guān)性研究

苗祥宇，徐麗，劉紅，張碩偉，吳情（江蘇省宿遷市人民醫(yī)院感染科 223800）

全球范圍內(nèi)原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)病率位居惡性腫瘤第5位，約55%的病例發(fā)生在國內(nèi)［1］。多項研究已證實慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是導(dǎo)致HCC 的重要原因之一，約有10%～25%HBV 感染患者最終發(fā)展為HCC［2］。在國內(nèi)，90%以上HCC患者伴有HBV 感染［3］。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，單核苷酸多態(tài)性（SNP）與腫瘤的遺傳易感性相關(guān)［4］。主要組織相容性復(fù)合體（MHC）－Ⅰ類鏈相關(guān)基因A（MICA）編碼一種應(yīng)激誘導(dǎo)性配體，主要與自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）活化型受體NKG2D 特異性結(jié)合，在NK 細(xì)胞活化和免疫監(jiān)視中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，MICA 多態(tài)性與惡性腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病等的易感性有密切關(guān)系。本研究旨在探討MICA 基因多態(tài)性以及血清中可溶性MICA 抗原含量與乙型肝炎源性HCC的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2009年9月至2013年6月本院收治并經(jīng)病理確診的HCC患者161例納入患者組，所有患者均為首次發(fā)病入院，未經(jīng)過放射、化學(xué)治療的患者；其中男131例，女30例，患者年齡22～80歲，平均（47.2±12.5）歲；所有患者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）均為陽性。將同期無血緣關(guān)系、在本院體檢健康者162例納入健康對照組，其中男130例，女32例；年齡24～74歲，平均（45.6±11.8）歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取基因組DNA 提取采用Wizard基因組DNA 純化試劑盒（美國Promega公司），操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。分光光度計分析DNA 濃度和純度，將濃度調(diào)整為50ng／μL。

1.2.2 基因分型運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物直接測序法對MICA 基因多態(tài)性位點rs2596542進(jìn)行基因分型。引物序列為：上游5′－TCG TCT CCC AAA GAA CAG CTA C－3′，下游5′－CCA GTC TCT GGA GTC ACT GTC－3′。PCR 總反應(yīng)體系為25μL，含DNA 模板1μL，2×PCR mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA 聚合酶0.5μL，去離子水9μL。PCR 預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，35個循環(huán)，72℃延伸7min。PCR 擴增產(chǎn)物片段為492bp。

1.2.3 血清MICA 水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、人MICA 檢測試劑盒（美國Sigma－Ald rich公司），操作按照說明書進(jìn)行操作。所有樣品均設(shè)3個復(fù)孔，設(shè)置酶標(biāo)儀波長450nm，讀取吸光度值，根據(jù)MICA 標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。Logistic回歸分析法計算比值比（OR）及95%置信區(qū)間（95%CI），以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 既往史與家族史比較患者組中有吸煙史、飲酒史、HCC家族史者明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 患者組和健康對照組的既往史與家族史比較（n）

2.2 MICA 基因多態(tài)性與HCC風(fēng)險經(jīng)Hardy－Weinberg平衡檢驗，健康對照組和患者組MICA 基因位點rs2596542基因型實際值與預(yù)測值比較，均符合Hardy－Weinberg 平衡（χ2＝2.344，P＝0.125和χ2＝3.420，P＝0.064）?；颊呓M中GG 基因型的分布頻率為23.6%，明顯高于健康對照組的16.0%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GG 基因型攜帶者HCC 發(fā)病風(fēng)險是AA 基因型攜帶者的1.860倍（OR＝1.860，95%CI：1.009～3.428）。攜帶G 等位基因者HCC 發(fā)病風(fēng)險高于A 等位基因攜帶者（OR＝1.412，95%CI：1.030～1.936）。

表2 rs2596542基因型在患者組與健康對照組的分布［n（%）或n］

2.3 MICA 基因多態(tài)性與血清MICA 水平本研究采用ELISA 方法對HCC患者和健康體檢者血清MICA 水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)患者組MICA 水平為（55.1±21.3）pg／mL，明顯高于健康對照組的（9.7±4.3）pg／mL，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析MICA 基因多態(tài)性與血清MICA 水平的關(guān)系，結(jié)果顯示，GG 基因型患者血清MICA 水平為（89.1±41.7）pg／mL，明顯高于AA 基因型的（18.2±9.5）pg／mL和AG 基因型的（35.8±17.4）pg／mL，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

MICA 基因是MIC基因家族的成員之一。MICA 是功能基因，在人體正常組織細(xì)胞表達(dá)量極低［5］。研究發(fā)現(xiàn)，MICA基因在大多數(shù)上皮來源的原發(fā)性腫瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等細(xì)胞上表達(dá)，被認(rèn)為與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［6］。NK 細(xì)胞活化受體NKG2D 可以識別表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的MICA／B。這些識別無須抗原處理和遞呈，并且無MHC 限制性。MICA／B與NKG2D 結(jié)合刺激NK 細(xì)胞的活化。膜MICA 可上調(diào)效應(yīng)細(xì)胞NKG2D 的表達(dá)，而膜MICA 可被基質(zhì)金屬蛋白酶水解釋放入血液?？扇苄訫ICA 的釋放不僅降低腫瘤細(xì)胞表面MICA 的表達(dá)，降低腫瘤的免疫原性，也能影響免疫效應(yīng)細(xì)胞表面NKG2D 的表達(dá)，進(jìn)而影響NK 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL細(xì)胞）抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮。張彩等［7］的研究也表明，可溶性MICA 通過降低NKG2D 的表達(dá)下調(diào)機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。上述研究表明，NKG2D－MICA 的相互作用可有效調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞和CTL細(xì)胞的殺腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎源性HCC 患者血清MICA 水平明顯高于健康對照組（P＜0.05），說明可溶性MICA 在肝癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，這種作用與腫瘤免疫逃逸作用機制有關(guān)。

人類MHC基因域位于6號染色體短臂，共含有224個基因座，包含MIC家族7個成員的編碼基因，其中MICA 位于經(jīng)典MHC－Ⅰ類基因域著絲粒的末端，具有6個外顯子，由5個內(nèi)含子隔開［8］。Kumar等［9］發(fā)現(xiàn)MICA 上游4.7kb的變異位點與丙型肝炎病毒引起的HCC 相關(guān)。Paulisally等［10］研究了MICA 基因多態(tài)性與丙型肝炎源性肝癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SNP rs2596538與丙型肝炎源性肝癌易感性相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，另一個MICA SNP位點rs2596542與乙型肝炎源性HCC 易感性相關(guān)，G 等位基因攜帶者HCC發(fā)病風(fēng)險明顯大于A 等位基因攜帶者［11］。本研究結(jié)果與Kumar等［9］的研究類似，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發(fā)病風(fēng)險高；或至少攜帶1個G 等位基因者比攜帶A 等位基因者更易患乙型肝炎源性HCC。SNP rs2596538G 等位基因攜帶者血清MICA 水平高于A 等位基因攜帶者，rs2596542G 等位基因攜帶者高于A 等位基因的攜帶者。本研究也發(fā)現(xiàn)，GG 基因型HCC患者血清MICA 水平明顯高于AA 基因型和AG 基因型患者（P＜0.05）?；貧w分析結(jié)果顯示，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發(fā)病風(fēng)險要高。上述研究結(jié)果表明，MICA 基因多態(tài)性可能通過提高可溶性MICA 水平，從而影響HCC易感性。

綜上所述，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科向癌癥研究領(lǐng)域的延伸，HCC 分子診斷方法取得了長足的進(jìn)展［12］。MICA 基因多態(tài)性和血清MICA 有可能成為乙型肝炎源性HCC 的生物學(xué)標(biāo)記。其在臨床診斷中的作用有待進(jìn)一步研究。

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