降糖三黃片對(duì)早期糖尿病腎病大鼠腎組織TGF－β1/Smad1信號(hào)通路的影響

江 丹 吳 偉 林明欣 朱章志

(1廣東省第二中醫(yī)院，廣州，510095;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，5104053;3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700;4廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州，510405)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，糖尿病病程25年以上患者中DN的累積患病率為25% ～40%[1]。DN是導(dǎo)致終末期腎病(End Stage Renal Disease，ESRD)的重要原因，已經(jīng)嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生命健康。ESRD需要透析治療，在歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家20% ～40%的糖尿病患者最終發(fā)展為DN，成為透析治療患者的首要原因[2]。雖然DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但是學(xué)界對(duì)于DN腎臟病變的發(fā)生和發(fā)展與一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子作用密切相關(guān)的學(xué)說(shuō)，已基本取得了共識(shí)。在生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子中作用最為突出的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1(Transforming Growth Factor－ β1，TGF－ β1)，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞及基質(zhì)生長(zhǎng)、分化，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的分泌。Smads家族蛋白是將 TGF－β信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白。TGF－β/Smad信號(hào)通路最終會(huì)形成低聚體復(fù)合物，激活核內(nèi)ECM成分如各型膠原Col－Ⅰ、Col－Ⅳ、纖維粘連蛋白(FN)等啟動(dòng)子的活性，從而增加ECM合成，導(dǎo)致腎纖維化。

降糖三黃片以桃核承氣湯為底方，加黃芪、生地黃、玄參、麥冬等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、泄熱逐瘀的作用，對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥具有一定的療效。在對(duì)糖尿病多種慢性并發(fā)癥的研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)加味桃核承氣湯能改善DN患者糖、脂代謝紊亂，減少24 h尿蛋白排泄量、提高內(nèi)生肌酐清除率[3]，減輕或延緩糖尿病鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜的增厚[4]。降糖三黃片能改善胰島素抵抗、降低DN大鼠尿蛋白、AngⅡ含量，抑制 DN 大鼠 PKC[5]和 TGF－ β1 的過(guò)度表達(dá)[6]，從而減少腎小球ECM的積聚，起到保護(hù)腎臟的作用。本研究的目的是通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)觀察降糖三黃片對(duì)血糖、24 h尿微白蛋白;TGF－ β1、Smad1、Co1－ Ⅳ的影響，以進(jìn)一步研究其對(duì)ECM的影響及機(jī)制，為該方對(duì)DN的臨床運(yùn)用提供更加充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑及儀器 降糖三黃片為廣州中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑(批號(hào):粵藥制字Z20071185);厄貝沙坦片(賽諾菲杭州制藥有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20080074);鏈脲佐菌素(Streptozin，STZ，美國(guó) Sigma公司);配制pH 4.2，0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。葡萄糖試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所);TGF－β1采用ELASA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。尿微量白蛋白用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;Smad1 pAb抗體試劑盒(Bioword技術(shù)公司);Anti－Smad3 Antibody試劑盒、Anti－CollagenⅠ Antibody試劑盒及Anti－CollagenⅣantibody試劑盒(Abcam技術(shù)公司);DAB顯色液、UltraSensitiveTMS－P超敏試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。TRIzol(批號(hào):28223)、M－MLV First Strand Kit(批號(hào):8212242)、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix－UDG(批號(hào):8212208)均由美國(guó)Invitrogen公司提供。特異性引物(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)。IQTM5型熒光定量PCR儀、SmartSpec Plus核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio－Rad公司)、Milli Q Plus超級(jí)純水儀(美國(guó)Millipore公司)、BX51型光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus)、MSHOT數(shù)碼成像系統(tǒng)(MC－20，廣州市明美光電技術(shù)有限公司)、MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(北京航空航天工業(yè)大學(xué))。

1.2 DN動(dòng)物模型的復(fù)制 SPF級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，體重180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度21～24℃，濕度50% ～70%，雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只;喂食SPF級(jí)鼠飼料，飲用無(wú)菌水。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機(jī)數(shù)字表分為2組，空白對(duì)照組(正常組)11只，造模組69只。造模前禁食12 h，造模組按30 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射STZ，正常組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后各組大鼠眼眶靜脈采血測(cè)定空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多尿、多食現(xiàn)象，確認(rèn)為2型糖尿病模型。繼續(xù)喂養(yǎng)8周至出現(xiàn)糖尿病大鼠的腎損害(電鏡結(jié)果為證)。

1.3 分組、給藥及喂養(yǎng) 造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)一步分為模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組。灌胃前用純凈水配制成1 mL混懸液配制藥品(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量換算公式:大鼠用量=生藥量×0.018×5)。厄貝沙坦組0.027 g·kg－1·d－1劑量灌胃，1 次/d;降糖三黃片組 0.675 g·kg－1·d－1的劑量灌胃，1次/d;正常組及模型組灌服等劑量蒸餾水。給藥8周后處死。中途死亡或不符合條件不列入統(tǒng)計(jì)分析，共35只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，正常組10只，模型組8只，厄貝沙坦組9只，降糖三黃片組8只。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般生化指標(biāo)檢測(cè) 分別在治療前、給藥后4周、8周處死前稱(chēng)體重和眼眶靜脈竇采血檢測(cè)葡萄糖。于DN造模成功后、處死前，分別用代謝籠收集24 h尿液計(jì)算尿微量蛋白排泄量。處死后摘取腎臟，右側(cè)腎臟去包膜稱(chēng)重，計(jì)算腎重/體重指數(shù)(腎重÷體重×100%)。取左側(cè)腎臟一部分，用10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，以便進(jìn)行免疫組化分析;另一部分置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 測(cè)定腎組織TGF－β1含量 取部分大鼠腎組織，采用雙抗體夾心ELASA法測(cè)定TGF－β1含量。計(jì)算OD值，使用軟件作圖，根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)TGF－β1含量。本次實(shí)驗(yàn) TGF－β1公式:R2=0.985 6，y=－7E－08x2+0.000 3x+0.068 1。

1.4.3 檢測(cè)腎組織Smad1、Col－Ⅳ免疫組化染色表達(dá)取石蠟切片，用二步法免疫組化染色檢測(cè)腎組織Smad1、Col－Ⅳ表達(dá)。取200倍顯微鏡視野，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性性號(hào)，用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4 熒光定量RT－PCR法檢測(cè)腎組織Smad1、Col－Ⅳ基因表達(dá)量 取腎組織100 mg，液氮下研磨，然后加入1 mL TRIzol試劑，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，在室溫下放置5 min。然后在4℃下12 000 r/min，離心10 min。取出上清液，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入1/5體積的氯仿，用力混勻2 min，4℃下12 000 r/min，離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，放入－20℃冰箱靜置0.5 h。取出后在4℃下12 000 r/min，離心10 min。棄上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗滌2次后，在室溫下干燥10 min。最后用200 μL滅菌超純水溶解沉淀，并且用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260/OD280比值，算出RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄的操作按照Invitrogen公司MMLV First Strand Kit提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，加入上述提取的總RNA，合成第一鏈cDNA。根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件，用于擴(kuò)增內(nèi)參18S(GenBank Accession no.M11188)以及Col－I(GenBank Accession no.NM_053304)，Col－ IV(GenBank Accession no.NM_001135009)，Smad1(GenBank Accession no.NM_013130)，Smad3(GenBank Accession no.NM_013095)。設(shè)計(jì)的引物序列如下:18S引物:R(5'－3'):CAGACTTGCCCTCCA、F(5'－ 3'):ACGGCTACCACATCC;Col－I引物:F(5'－3'):CGATGGCGTGCTATGC、R(5'－3'):ACTTCTGCGTCTGGTGATA;Col－IV 引物:F(5'－3'):TACCTCACTGTCCACTATG、R(5'－3'):CTGTCTGTCCTTCTCCTT;Smad1引物:F(5'－3'):CGTGTTGGTGGATGGT、R(5'－ 3'):GATGTGTCGCCTGGTAT;Smad3 引物:F(5'－3'):ACTACAGCCATTCCAT、R(5'－3'):TTCTCCATCTTCACTCA.基因表達(dá)的檢測(cè)按照所示組分進(jìn)行添加，然后放入熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。將上述反應(yīng)混合物放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。步驟1:94℃ ×5 min;步驟2:94℃ ×30 s→55℃ ×30 s→72℃ ×50 s(45個(gè)循環(huán));步驟3:72℃ ×7 min。每組10個(gè)樣品，分別取1 μL作為cNDA模板擴(kuò)增，運(yùn)用2－△△Ct法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。具體計(jì)算公式為:F=2－[(待測(cè)組目的基因平均Ct值－待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值)－(對(duì)照組目的基因平均Ct值－對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)]

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包分析系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間均值比較采用單因素方差分析，或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。若方差齊，組間均值兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，改用Dunnett T3檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般生化指標(biāo)比較 血糖比較:治療前及治療后第4周，正常組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。治療后第8周，正常組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，厄貝沙坦組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明STZ造模后各組血糖明顯升高，但相對(duì)于模型組、厄貝沙坦組，表明降糖三黃片能一定程度降低血糖，減輕高糖毒性(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較(±s)

表1 各組大鼠治療前后血糖比較(±s)

注:兩兩比較用Dunnett T3檢驗(yàn)。與模型組相比，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 血糖(mmol/L)治療前 4周 8周正常 10 4.96±0.86＊＊△△ 5.24±0.87＊＊△△ 7.04±1.28＊＊△△0.000 0.000 0.000模型 8 29.42±3.89 39.78±4.45 50.30±5.51厄貝沙坦 9 26.04±3.92 36.59±5.03 47.08±6.14降糖三黃片 8 24.77±4.30 34.53±5.93 38.26±5.09＊＊△△F值 98.35 126.91 161.13 P值

治療前各組體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。造模后4周、8周體重比較:正常組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

腎重/體重指數(shù)比較:正常組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，降糖三黃片與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。腎重/體重指數(shù)比增大表明造模后各組大鼠均有存在腎肥大、腎損傷的情況，降糖三黃片與厄貝沙坦同樣具有減輕腎臟肥大的作用(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠治療前后體重、腎重/體重指數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠治療前后體重、腎重/體重指數(shù)比較(±s)

注:體重用兩兩比較用LSD法。腎重/體重指數(shù)用兩兩比較用Dunnett T3檢驗(yàn)。與模型組相比，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 體重(g)造模前 造模后4周 8周 腎重(g) 腎重/體重正常 10 194.05±13.39 230.13±12.27＊＊△△ 261.91±18.11＊＊△△ 0.87±0.06 0.00332±0.00017＊＊△△模型 8 194.00±7.57 166.05±11.39 152.11±21.11 0.91±0.05 0.00609±0.00073厄貝沙坦 9 196.22±11.15 175.41±18.57 157.53±21.91 0.84±0.11 0.00534±0.00048降糖三黃片 8 198.13±8.63 168.96±14.77 161.66±11.89 0.84±0.08 0.00521±0.00061 F值 0.29 40.9 74.7 1.669 47.157 P值0.832 0.000 0.000 0.194 0.000

治療前各組尿微量白蛋白比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療后第8周，正常組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，正常組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，降糖三黃片與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明降糖三黃片能有效降低早期DN大鼠尿微量白蛋白，從而保護(hù)腎功能，且療效與厄貝沙坦片接近(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠治療前后尿微量白蛋白比較(±s)

表3 各組大鼠治療前后尿微量白蛋白比較(±s)

注:兩兩比較用LSD法。與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) 尿微量白蛋白(mg/24 h)治療前 8周正常 10 29.34±14.13 43.29±22.53＊＊△△0.628 0.000模型 8 24.62±10.18 403.28±134.09△△厄貝沙坦 9 23.55±10.66 245.74±130.43＊＊降糖三黃片 8 23.81±6.29 235.06±87.31*F值 0.59 19.02 P值

2.2 測(cè)定腎組織TGF－β1含量 治療后第8周，正常組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組TGF－β1含量與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表4)。

2.3 檢測(cè)腎組織Smad1、Col－Ⅳ免疫組化染色表達(dá)

光鏡下免疫組化染色顯示smad1陽(yáng)性表達(dá)部位為腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)。正常組呈弱陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1A);模型組呈陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，陽(yáng)性顆粒為棕黃色(見(jiàn)圖1B);厄貝沙坦組和降糖三黃片組比模型組陽(yáng)性表達(dá)程度顯著減弱(見(jiàn)圖1C、圖1D)。

Smad1染色指數(shù)比較:正常組、模型組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)(見(jiàn)表4)。

圖1 腎組織Smad1

光鏡下免疫組化染色顯示Col－Ⅳ陽(yáng)性表達(dá)部位為腎小球毛細(xì)血管和腎小管基底膜。正常組呈陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖2A);模型組陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，陽(yáng)性顆粒為棕黃色(見(jiàn)圖2B);厄貝沙坦組和降糖三黃片組比模型組陽(yáng)性表達(dá)程度減弱(見(jiàn)圖2C、圖2D)。

圖2 免疫組化染色表達(dá)

表4 各組大鼠治療后TGF－β1含量、Smad1染色指數(shù)、Col－Ⅳ染色指數(shù)比較(±s)

表4 各組大鼠治療后TGF－β1含量、Smad1染色指數(shù)、Col－Ⅳ染色指數(shù)比較(±s)

注:兩兩比較用LSD法。與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數(shù) TGF－β1(pg/mg) 染色指數(shù)=平均光密度值×面密度值Smad1 Col－Ⅳ正常 10 265.23±84.49＊＊△△ 0.0382±0.0115＊＊△0.0529±0.0147＊＊△0.000 0.000 0.000模型 8 694.21±153.94△△ 0.0800±0.0164△△ 0.0849±0.0125△厄貝沙坦 9 429.87±146.60＊＊ 0.0565±0.0109＊＊ 0.0704±0.0132*降糖三黃片 8 390.86±100.91＊＊ 0.0599±0.0204* 0.0648±0.0156＊＊F值 18.372 11.734 7.876 P值

Col－Ⅳ染色指數(shù)比較:正常組、模型組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.076)(見(jiàn)表4)。

3 討論

TGF－β的分布有一定的組織特異性，腎臟以TGF－β1為主，主要在腎小管上皮細(xì)胞，其次是腎小球。TGF－β1可直接刺激FN、Col－Ⅰ型和Col－Ⅳ的形成，體外細(xì)胞培養(yǎng)表明持續(xù)或間斷的高糖環(huán)境可促使TGF－β1的產(chǎn)生和活化，TGF－β1可誘導(dǎo) I、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN的表達(dá)[7]。此外，TGF－β1還能破壞腎小球?yàn)V過(guò)屏障，參與炎性反應(yīng)、組織修復(fù)，促使腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，而這正是DN腎臟損害的基本病理機(jī)制[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:造模后各組TGF－β1與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);表明STZ造模后大鼠TGF－β1含量增加，而降糖三黃片、厄貝沙坦均能明顯抑制DN大鼠腎組織中TGF－β1的表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致[3]。

Smads家族蛋白是參與TGF－β超家族在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一組蛋白質(zhì)，迄今為止，在哺乳動(dòng)物已經(jīng)分離鑒定的Smad蛋白有9種。Smads家族按功能可分成3類(lèi)[9]:1)受體活化性或通路限制性 Smad(RSmads)，由于可以由活性的TβR激活發(fā)生磷酸化而得名，是專(zhuān)門(mén)轉(zhuǎn)導(dǎo) TGF－β家族中某條信號(hào)通路的Smad;2)共配偶體Smad，它是TGF－β族各類(lèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中共同需要的介質(zhì);3)抑制性Smad，它們也可與Ⅰ型受體結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)的穩(wěn)定性比受體激活型Smad更強(qiáng)，因而限制受體激活型Smad被磷酸化，抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。其中 Smad1作為 R－Smads，參與BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響 Col－ Ⅳ表達(dá)[10]。Matsubara等[11]在體外證實(shí)了高糖狀態(tài)下Smad1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Col－Ⅳ的表達(dá);同時(shí)證實(shí)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在24周時(shí)表現(xiàn)出程度不等的腎小球硬化;通過(guò)Western blot和免疫組化檢測(cè)及相關(guān)性分析證實(shí)大鼠腎小球Smad1的表達(dá)水平與腎小球硬化的程度呈明顯正相關(guān)，且與腎小球Col－Ⅳ和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)的表達(dá)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)治療后第8周smad1基因表達(dá)量比較:模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與正常組相比有升高(P＜0.05)，厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組比較降低(P＜0.05)。降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比，P=0.08，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但分析數(shù)據(jù)考慮接近0.05，可能與實(shí)驗(yàn)例數(shù)過(guò)少有關(guān)，若增大例數(shù)重新統(tǒng)計(jì)，可能有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Col－Ⅳ是構(gòu)成ECM的重要生化成分，也是腎小球基底膜(Glomerular Basement Membrane，GBM)的主要構(gòu)成蛋白，約占GBM干體質(zhì)量的50%，可決定GBM的強(qiáng)度及孔徑選擇性，故Ⅳ－C合成和降解異常勢(shì)必影響腎臟結(jié)構(gòu)與功能，DN時(shí)腎臟的Ⅳ－C表達(dá)增加[12]。Ziyadeh等證實(shí)體外高糖培養(yǎng)的腎近曲小管細(xì)胞和系膜細(xì)胞均有TGF－β1 mRNA表達(dá)及生物活性增加，同時(shí)分泌col－Ⅰ及col－Ⅳ增多，這種變化能被抗TGF－β1抗體抑制[13]。本實(shí)驗(yàn)治療后第8周Col－Ⅳ基因表達(dá)量比較:模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與正常組相比有升高 (P＜0.05)，厄貝沙坦組與模型組比較降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);降糖三黃片組與模型組相比有下降，P=0.076，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但分析數(shù)據(jù)考慮接近0.05，可能與實(shí)驗(yàn)例數(shù)過(guò)少有關(guān)，若增大例數(shù)重新統(tǒng)計(jì)，可能有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病早期常有多飲、多食、多尿、大便干結(jié)或便秘等“胃腸燥熱”的癥狀。發(fā)展至早期DN時(shí)，因大量蛋白從尿中丟失，出現(xiàn)尿濁 (蛋白尿);除此，多伴有血脂代謝紊亂、疲倦、肢麻等表現(xiàn)。早期DN病機(jī)以氣陰兩虛為本，胃腸燥熱為標(biāo)，兼夾痰濕、瘀濁[14]。從《傷寒論》六經(jīng)辨證，提出DN當(dāng)屬五行中的“土”病及“水”病，因胃屬于陽(yáng)明，腎屬于少陰。為陽(yáng)明、少陰病熱證，宜破血下瘀，急下存少陰之津，以求瀉土布津。因降糖三黃片具有益氣養(yǎng)陰、泄熱逐瘀的作用，故用于早期DN治療。研究結(jié)果表明降糖三黃片具有明顯降低血糖、尿微量白蛋白的作用，與既往采用加味桃核承氣湯水煎劑灌胃治療的結(jié)論一致[3]。降糖三黃片還可通過(guò)抑制腎組織TGF－β1/smad1通路的表達(dá)，降低Col－Ⅳ的沉積，使腎臟的異常結(jié)構(gòu)得到改善，降低腎重/體重指數(shù)比，延緩腎小球硬化。推測(cè)降糖三黃片可能是通過(guò)改善糖脂代謝紊亂，降低腎組織AngⅡ水平[5];同時(shí)，通過(guò)增加胰島素敏感性[15]，降低血糖，減少AGEs沉積，從而抑制TGF－β1表達(dá)，抑制腎小管細(xì)胞肥大及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成ECM，達(dá)到保護(hù)腎功能延緩DN發(fā)展的目的。這一結(jié)論是對(duì)降糖三黃片療效的肯定，為臨床應(yīng)用降糖三黃片治療早期DN提供了分子生物學(xué)理論依據(jù)。

[1]Atsuhiro Ichihara，Mariyo Sakoda，Asako Mito－ Kurauchi，et al.Activated prorenin as a therapeutic target for diabetic nephropathy[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2008，82(1):S63－ S66.

[2]Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy[J].J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4(8):444－452.

[3]王廷春，范冠杰，歐翠柳.加味桃核承氣湯治療糖尿病腎病138例臨床觀察[J].國(guó)醫(yī)論壇，2000，15(2):10－12.

[4]熊曼琪，苗理平.加味桃核承氣湯對(duì)糖尿病鼠腎超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1990，5(5):25－27.

[5]陳云，李賽美，王保華.降糖三黃片對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織蛋白激酶C和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響[J].中醫(yī)雜志，2012，53(8):689－692.

[6]陳云，李賽美，王保華.降糖三黃片對(duì)糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(2):154－159.

[7]Poneelet AC，Schnaper HW.Regulation of human mesangial cell collagen expression by transforming growth factor－ betal 1[J].Am J Physiol，1998，275(3Pt2):F458－466.

[8]Wolf g，Ziyadeh FN，Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy[J].Kidney Int，1999，56(2):393－405.

[9]馬云，肖煒，候連兵.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β信號(hào)通路與糖尿病腎病[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(11):1293－1296.

[10]Hideharu Abe，Takeshi Matsubara，Noriyuki Iehara，et al.Type IV collagen is transcriptionally regulated by Smad1 under advanced glycation end product(AGE)stimulation[J].J.Biol.Chem，2004，279(14):14201－14206.

[11]Matsubara T，Abe H，Aria H，et al.Expression of Smad1 is directly associated with Mesantial matrix expansion in rat diabetic nephropathy[J].Lab Invest，2006，86(4):357－368.

[12]LIU Y，WANG Z，Y IN W，et al.Severe insulin resistance and moderate glomeruloselerosis in a minipig model induced by high－fat/high－sucrose/high－ cholesterol diet[J].Exp Anim，2007，56(1):11－ 20.

[13]Ohashi S，Abe H，Takahashi T，et al.Advanced glycation end products increase collagen－specific chaperone protein in mouse diabetic nephropathy[J].J Biol Chem，2004，279(19):19816－19823.

[14]蘇克雷，朱垚，郭立中.國(guó)醫(yī)大師周仲瑛治療糖尿病腎病經(jīng)驗(yàn)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(11):2854－2857.

[15]熊曼琪，林安鐘，朱章志，等.加味桃核承氣湯對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17(3):165－168.