常規(guī)基因檢測陰性的地中海貧血疑似病例再行進一步基因檢測仍有7%的陽性發(fā)現(xiàn)

呂榮鈺 文飛球 陳小文 張 民 陳仕平 李 劍

Hb病包括地中海貧血(簡稱地貧)和異常Hb病。地貧是由一種或多種珠蛋白肽鏈合成部分或完全抑制，導(dǎo)致Hb含量異常，以α地貧和β地貧最常見［1］。全球229個國家中，71%的國家受Hb病這一重大健康問題困擾［2］。全球近5億人為Hb異?；驍y帶者，每年30～50萬新出生兒童為重型的純合狀態(tài);5歲以下死亡兒童中約3.4%死于Hb?。?］。目前治療Hb病的方法有限，臨床實踐證實通過早期篩查及遺傳咨詢來預(yù)防和減少Hb病患兒出生是最有效的解決方案，因此明確Hb病的致病基因相當(dāng)重要。

地貧數(shù)據(jù)庫(http://globin.bx.psu.edu/)資料統(tǒng)計，迄今已發(fā)現(xiàn)1 600余種Hb基因異常類型，近10年新發(fā)現(xiàn)180余種。臨床上根據(jù)血液學(xué)分析行地貧初篩，確診仍依賴于基因檢測［3］。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，部分患兒雖有地貧樣表現(xiàn)，血液學(xué)初篩陽性，而常規(guī)基因檢測卻呈陰性，不能解釋病因，同時臨床常規(guī)基因檢測也可能有一定的漏檢率。為此，本研究針對這部分群體再進一步行地貧常規(guī)基因和罕見基因的測序和突變類型分析，能進一步明確多少比例的地貧病因，豐富地貧病因?qū)W認識，為臨床診斷提供參考。

1 方法

1.1 倫理 本研究獲得深圳市兒童醫(yī)院(我院)生物倫理委員會審核同意。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 我院地貧血液學(xué)初篩陽性且常規(guī)基因檢測陰性的疑似地貧的連續(xù)病例，且獲得患者及其家長的書面知情同意再行進一步地貧基因檢測。

1.3 地貧血液學(xué)初篩 應(yīng)用CAPILLAPYS2全自動電泳儀(西比亞，法國)進行Hb電泳分析，全自動血液分析儀XS-1000i(希森美康，日本)進行血液分析，UV-5200紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)比值及紅細胞滲透脆性。①貧血:Hb＜該年齡段正常值下限和(或)RBC平均容積(MCV)＜80 fl和(或)RBC平均Hb量(MCH)＜28 pg;②地貧篩查指標(biāo):HbA2和(或)胎兒Hb(HbF)＞該年齡段上限值和(或)RBC滲透脆性＜0.6;①或②項指標(biāo)陽性定義為地貧血液學(xué)初篩陽性。

1.4 地貧常規(guī)基因檢測 對于地貧血液學(xué)初篩陽性患者，采集外周靜脈血3mL(EDTA-K3抗凝)，使用基因組DNA快速提取試劑盒提取全血DNA。采用跨越斷裂點PCR(Gap-PCR)技術(shù)測定3種缺失型 α地貧(-α3.7、-α4.2和--SEA)，PCR 反向探針點雜交(reversedot blot，RDB)技術(shù)檢測3種非缺失型α地貧(Hb Constant Spring、Hb Quong Sze、Hb Westmead)，以及17種 β地貧點突變［CD41-42(-TCTT)，IVS-2-654(C ＞T)，CD17(A ＞T)，-28(A ＞G)，CD26(G ＞A)，CD71-72(+A)，CD43(G ＞T)，-29(A＞G)，起始密碼子 ATG ＞AGG，CD14-15(+G)，CD27-28(+C)，-32(C＞A)，-30(T＞C)，IVS-1-1(G ＞T)，IVS-1-5(G ＞C)，CD31(-C)，CAP+40-+43(-AAAC)］?；蚪MDNA提取試劑盒以及診斷試劑盒購自深圳益生堂生物公司，由我院兒科研究所專業(yè)人員嚴格按照說明書操作。

1.5 地貧進一步基因檢測 地貧血液學(xué)初篩指標(biāo)陽性且我院常規(guī)基因檢測陰性樣本，送深圳華大基因研究所檢測。檢測除涵蓋了上述的常規(guī)基因以外，還包括地貧的罕見基因。

對于地貧突變類型，設(shè)計3對特異性引物用于檢測HBA1、HBA2和HBB 3個基因的突變。每個反應(yīng)體系為25μL，包含 5μL 基因組 DNA、12.5μL 2 × Gold StarTaq Master Mix(康為世紀)、0.4μmol·L-1引物，在 ABI 9700 PCR 儀(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)上完成擴增。實驗條件為95℃ 10 min;95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán);72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后在ABI3730xl DNA Analyzer測序儀(Applied BioSystems)上進行正反雙向測序，結(jié)果采用Chromas和DNAstar軟件分析。

對于地貧缺失類型，采用文獻報道的Gap-PCR方法檢測 α地貧5種缺失型(--SEA、-α3.7、-α4.2、--FIL、--THAI)［4］。同時采用文獻報道的熒光定量PCR的方法檢測非常見的α和β地貧缺失類型和拷貝數(shù)異常［5，6］。

1.6 資料截取 對地貧血液學(xué)初篩指標(biāo)陽性且常規(guī)基因檢測陰性病例，再進一步行基因檢測陽性者，從病歷中截取基因檢測結(jié)果、年齡和血液學(xué)篩查結(jié)果行描述性分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2011年1～9月我院地貧血液學(xué)初篩陽性878例，其中常規(guī)基因檢測陰性患者285例(32.5%)，年齡10d至34歲;其中0～6月齡18例，～6歲209例，～16歲52例，＞16歲6例，平均年齡為(26.5±33.9)個月。

2.2 進一步基因檢測結(jié)果 21/285例(7.4%)檢測陽性，其中常規(guī)基因檢測陽性5例(1.8%)，罕見基因檢測陽性16例(5.6%)。21例患者的基因檢測結(jié)果和臨床資料如表1所示。

2.2.1 常規(guī)基因突變測序 檢出非缺失型β地貧27/28(+C)和41/42(+C)各2例，IVS-II-654(C＞T)1例。

2.2.2 罕見基因突變測序結(jié)果 ①異常Hb病:1例DNA測序證實在CD91處275T＞C(CTT＞CCT，Leu＞Pro)，且為雜合子(圖1)，查詢地貧數(shù)據(jù)庫為異常Hb Port Phillip型 。該例為新生兒，10日齡，血液分析提示小細胞低色素性貧血。檢出異常Hb J-Bangkok和Hb Ernz各1例，查詢地貧

數(shù)據(jù)庫，Hb J-Bangkok類型為CD56處170G＞A(GGC＞GAC，Gly＞Asp)，血常規(guī):RBC 3.94 ×1012·L-1、Hb 113 g·L-1、MCV 83.3 fl、MCH 28.7 pg，均在正常范圍。Hb Ernz為CD123處371C＞A(ACC＞AAC，Thr＞Asn)(圖2)［7］，在亞洲人群中首次發(fā)現(xiàn)。本例Hb Ernz攜帶者為男嬰，9月齡，基因測序提示為雜合子，血液學(xué)檢查結(jié)果示:RBC 4.68 ×1012·L-1，Hb 85 g·L-1，MCV 降低(62.6 fl)，MCH降低(18.2 pg)，HbF正常(0.36%)，HbA2 降低(2.36%)，鐵蛋白降低(4.3 ng·μL-1)。②β基因非缺失型:檢出非缺失型β地貧-90(C＞T)2例，為罕見β地貧類型。

2.2.3 Gap-PCR和熒光定量PCR分析 ①α基因缺失型:檢出非常見缺失型α地貧5例，其中-α/αα 2例、--/αα 3例。血液學(xué)檢查均呈小細胞低色素性貧血，且為輕度貧血，僅1例HbA2降低，其余Hb電泳正常。②β基因缺失型:檢出缺失型β地貧(-/β)3例。血液學(xué)檢查示小細胞低色素性RBC，無貧血，Hb電泳示HbF明顯升高。③α地貧合并β地貧:1例成年女性(例21)檢出地貧基因型為--/αα合并-/β，其中α缺失為非常見類型。④α-三聯(lián)體:2例為α基因三聯(lián)體(ααα/αα)，未合并β地貧，未進一步分型，2例均無貧血(Hb 121～134 g·L-1)，RBC呈小細胞低色素狀態(tài)(MCV 75.5～77.1 fl、MCH 26.2～27.2 pg)，Hb電泳未見異常。

表1 地貧疑似病例再進一步行基因檢測陽性21例的基因型和血液學(xué)檢查結(jié)果Tab 1 Genotypes and blood test results of 21 suspected thalassemia cases with negative result in regular genedetection

圖1 Hb Port Phillip雜合型突變Fig 1 Hb Port Phillip mutation

圖2 Hb Ernz雜合型突變Fig 2 Hb Ernz mutation

2.3 進一步基因檢測陰性患者的血液學(xué)檢查結(jié)果 99/264例進一步基因檢測陰性患者行血液學(xué)檢查，66.7%(60/90)鐵蛋白低于正常值，其中44例Hb和(或)MCV和(或)MCH低于正常值下限;另有3例提示貧血，但鐵蛋白值顯著升高(571～1 557 ng·μL-1);8例提示G6PD降低(0.6～0.8)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，285例地貧血液學(xué)初篩陽性且常規(guī)基因檢測陰性的患者中，檢出21例(7.4%)基因異常，其中常規(guī)基因漏診5例(1.8%)，提示目前的常規(guī)基因檢測方法可能低估了地貧及異常Hb病攜帶者的數(shù)據(jù)。Sanger基因測序檢出常見β珠蛋白點突變［CD27-28(+C)、CD41-42(-TCTT)、IVS-2-654(C＞T)］5例，檢出罕見β地貧點突變［-90(C＞T)beta+)］2例;熒光定量PCR檢出非常見缺失型 α地貧(-α/αα、--/αα)5例，為除-α3.7、-α4.2、--SEA、--THAI和 --FIL以外的罕見缺失類型(如 -α3.5、--CL、--CI等)，需進一步分子鑒定以明確分型［7］。因此，對于臨床發(fā)現(xiàn)和血液學(xué)初篩疑似地貧的患兒，即使常規(guī)基因檢測無異常，仍不能除外Hb病，必要時檢測罕見突變類型明確診斷。

本研究首次在亞洲人群發(fā)現(xiàn)異常Hb Ernz類型突變(CD123Thr＞Asn)，豐富了亞洲及中國Hb異?；蚍N類。文獻報道該突變僅在意大利人中檢出，位于Hb四聚體外部β鏈上，對Hb穩(wěn)定性影響小，可導(dǎo)致RBC增多，機制尚不清楚，需進一步研究［8］。本文檢出的該例患兒RBC正常，Hb、MCV、MCH及鐵蛋白均降低，可能為嬰兒期合并營養(yǎng)性缺鐵性貧血所致。

本文1例Sanger基因測序為異常Hb Port Phillip(CD91處Leu＞Pro)，血液學(xué)檢查提示為小細胞低色素性貧血。該突變僅見于1977年新西蘭1例中國裔女性［9］，該突變位于α鏈，可導(dǎo)致Hb穩(wěn)定性降低［9］。查詢?nèi)祟愐吧虷b X射線結(jié)構(gòu)(PDB 代碼:1HHO)［10］，采用 Swiss-PdbViewer軟件進行三維結(jié)構(gòu)分析得知，α肽鏈CD91處氨基酸靠近亞鐵血紅素原卟啉部位，而鐵與原卟啉配位結(jié)合，且鐵可與氧結(jié)合;氨基酸的改變可能引起Hb構(gòu)象改變，影響鐵與氧結(jié)合，導(dǎo)致穩(wěn)定性降低和發(fā)生溶血性貧血。文獻報道中國人群Hb J-Bangkok較常見，且對個體臨床表型影響?。?1］，本文1例測序為Hb J-Bangkok類型。

本研究還檢測出2例 α-三聯(lián)體(ααα/αα)，除 RBC 呈小細胞低色素狀態(tài)，其他篩查指標(biāo)均正常，提示僅存在此種類型拷貝數(shù)增加情況可能對患者Hb功能影響較小。但也有文獻報道拷貝數(shù)增加可能加劇β地貧患者α鏈和β鏈的不平衡趨勢，使臨床表現(xiàn)更顯著［12，13］。

基因測序和PCR結(jié)果陰性的264例患者，44/60例鐵蛋白降低，且Hb和(或)MCV和(或)MCH降低，考慮營養(yǎng)性缺鐵性貧血可能。3例雖有貧血，但鐵蛋白值顯著增加，可能與炎癥等疾病有關(guān)，需進一步檢測明確病因。8例G6PD比值低于正常值，考慮G6PD缺乏癥可能。

本研究提示，對于常規(guī)基因檢測陰性的疑似地貧患者，仍有1.8%的常規(guī)基因漏檢率和5.6%的罕見基因突變，因此對這部分人群有必要進一步行常規(guī)基因的復(fù)檢和罕見基因的檢測。

本研究不足和局限性，檢出的地貧非常規(guī)基因突變的病例數(shù)較少，尚不能建立基因型和表型之間的關(guān)系，待擴大樣本后進行分析，對于臨床表型有針對性的進行相應(yīng)基因的檢測。

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