龜羚帕安丸對帕金森病大鼠模型多巴胺能神經(jīng)元凋亡影響的研究*

孟 毅，喬明亮，寧亞紅，常學(xué)輝

(1．河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州450002; 2．河南中醫(yī)學(xué)院2012 級碩士研究生，河南鄭州450046)

帕金森病(Parkinson's dieses，PD)是以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢異常為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。隨著現(xiàn)代社會人口老齡化，PD 發(fā)病率有逐年增高的趨勢，治療上多以左旋多巴替代性療法和對癥治療為主，但長期服用會致不良反應(yīng)日趨嚴重。中醫(yī)學(xué)對帕金森病的認識有悠久的歷史，對帕金森病的治療經(jīng)驗亦頗豐。龜羚帕安丸是趙國華教授的經(jīng)驗用方，對帕金森病的治療有顯著療效［1］。本研究擬通過實驗的方法探討龜羚帕安丸治療帕金森病的作用機制，為其治療帕金森病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動 物

SD 大鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量(200 ±20)g，由河南省實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(豫)2010－0002。飼養(yǎng)條件:在河南省中醫(yī)院中心實驗室〔使用許可證為SYXK(豫)2011－0002)〕飼養(yǎng)，SPF 級飼料，IVC 大鼠獨立通風(fēng)飼育盒，溫度18～26 ℃，濕度40%～70%。

1．2 藥品、試劑與儀器

龜羚帕安丸，由龜板、羚羊角、全蝎、威靈仙、厚樸等組成，為河南省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號20130511。美多芭(多巴絲肼片)，上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品，批號SH1652。6－羥基多巴胺(批號SLBF550V)、阿撲嗎啡(批號SLBF6369V)，均購自美國Sigma 公司。細胞凋亡試劑盒(批號09F20C)、兔抗 Bax (批 號 08G19B)、兔 抗 Bcl-2 (批 號08H12D)、DAB 顯色試劑盒(批號130304)、PBS 緩沖液(批號130617)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠腦立體定向儀，美國Stoelting 公司產(chǎn)品;牙科鉆、5 μL 微量進樣器，均為上海安亭微量進樣器廠產(chǎn)品;Olympus 光學(xué)顯微鏡，產(chǎn)地日本。

1．3 模型的建立

參照周厚廣等［2］帕金森病大鼠模型的建立。將SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，進行反復(fù)行為檢測，選擇無旋轉(zhuǎn)行為的作為實驗對象。隨機分為假手術(shù)組、實驗組和正常對照組。實驗組采用以下方法造模:①腦立體定向儀定位。稱大鼠體質(zhì)量;以35 g/L水合氯醛8 μL/g 腹腔注射麻醉;以嚴格顱平位(前囟與后囟水平高度相差0．1 mm 以下)將大鼠固定于大鼠腦立體定向儀上;常規(guī)消毒，備皮;沿正中線切開頭皮，剝?nèi)ス悄?，露出前后囟，參照文獻［3］確定左側(cè)黑質(zhì)致密部(SNC)﹝(前囟后(5．0 ±0．2)mm，矢狀縫左側(cè)(1．7 ±0．1)mm，顱骨表面下(7．6 ±0．1)mm﹞，用牙科鉆小心鉆透顱骨。②微量進樣器注射。按確定坐標(biāo)將微量進樣器按1 mm/min的速度緩慢進針到預(yù)定深度;注入6-OHDA(溶于含質(zhì)量分數(shù)0．2 g/L 抗壞血酸的生理鹽水4 μL 中)8 μg，注射速度為1μL/ min;留針30 min;緩慢(1 mm/min)退針。術(shù)后用牙科膠覆蓋鉆孔，常規(guī)縫合傷口，連續(xù)3 d 腹腔注射青霉素10 萬U/kg 預(yù)防感染。

假手術(shù)組只注射含0．2 g/L 抗壞血酸的等量生理鹽水，其余條件與造模手術(shù)相同。術(shù)后10 d 開始行為檢測，以阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)按0．5 μg/g 體質(zhì)量腹腔注射，觀察其行為變化。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向右側(cè)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7 r/ min，則視為成功PD 大鼠模型;若大鼠不出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)方向不恒定、恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)或恒定轉(zhuǎn)向右側(cè)但速度較慢(＜7 r/min)，則視為不成功PD 模型。

1．4 動物分組與給藥

將造模成功的PD 大鼠隨機分為模型對照組、美多巴組和龜羚帕安丸大、中、小劑量組5 組。分別每日管飼同等容積的生理鹽水、美多芭10 μg/(g·d)、龜羚帕安丸4．0 ，2．0，1．0 g/(kg·d)。另設(shè)假手術(shù)組，常規(guī)飼養(yǎng)，每日管飼同等容積的生理鹽水。1 d 1 次，共30 d。

1．5 檢測指標(biāo)

1．5．1 取 材

實驗結(jié)束后，取每組動物進行心臟灌注固定:以35 g/L 水合氯醛8 μL/g 給予深度麻醉后打開胸腔，暴露心臟;經(jīng)左心室行主動脈灌注固定，先用生理鹽水200 mL 進行預(yù)灌注，灌注速度由快轉(zhuǎn)慢，直到從右心耳流出的液體變清亮，再用40 g/L 多聚甲醛200 mL 灌注，當(dāng)見到大鼠雙后肢抽搐，尾部變黃，表示灌注完成。完整剝?nèi)∧X組織，分離出中腦黑質(zhì)，在同一固定液中4 ℃固定4～6 h。

1．5．2 黑質(zhì)TUNEL 陽性細胞數(shù)

采用TUNEL 法觀察。常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚為5 μm，按試劑盒方法操作。

1．5．3 Bax、Bcl-2 陽性細胞數(shù)

采用免疫組化法檢測。采用抗生物素－ 生物素－ 過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法，按試劑盒方法操作。在光鏡高倍鏡下隨機取4 mm2視野，計算染色陽性細胞數(shù)。分析軟件使用IMS 彩色圖像分析系統(tǒng)軟件。

1．6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多樣本組間比較采用方差分析。以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠黑質(zhì)細胞凋亡陽性細胞數(shù)及Bcl-2、Bax 陽性細胞數(shù)升高，Bcl-2/Bax的比值下低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。與模型對照組對比，龜羚帕安丸大、中、小劑量組及美多芭組大鼠黑質(zhì)細胞凋亡陽性細胞數(shù)及Bax 陽性細胞數(shù)降低，Bcl-2 陽性細胞數(shù)及Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。與美多芭組對比，龜羚帕安丸大劑量組Bax 陽性細胞數(shù)降低，Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05 或P＜0．01);大鼠黑質(zhì)細胞凋亡陽性細胞數(shù)、Bcl-2 陽性細胞數(shù)對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。與龜羚帕安丸中、小劑量組對比，大劑量組大鼠黑質(zhì)細胞凋亡陽性細胞數(shù)及Bax 陽性細胞數(shù)降低，Bcl-2陽性細胞數(shù)及Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05 或P＜0．01)。見表1。

表1 各組大鼠黑質(zhì)TUNEL 陽性細胞數(shù)、Bcl-2、Bax 陽性細胞數(shù)及Bcl-2/Bax 對比 個，±s

表1 各組大鼠黑質(zhì)TUNEL 陽性細胞數(shù)、Bcl-2、Bax 陽性細胞數(shù)及Bcl-2/Bax 對比 個，±s

注:與假手術(shù)組對比，＊＊＊P ＜0．01;與模型對照組對比，### P ＜0．01;與美多芭組對比，△P ＞0．05，△△△P ＜0．01;與龜羚帕安丸中劑量組對比，＊＊＊P ＜0．01，＊＊ P ＜0．05;與龜羚帕安丸小劑量組對比，▲▲▲P ＜0．01。

組 別 動物數(shù) 凋亡細胞數(shù)/個 Bcl-2/個 Bax/個Bcl-2/Bax假手術(shù)組 8 3．1±0．43 4．23±0．63 4．43±1．77 1．08±0．39模型對照組 8 38．01±3．24＊＊＊ 14．34±2．43＊＊＊ 38．64±4．40＊＊＊ 0．36±0．02＊＊＊美多芭組 8 8．60±0．94### 40．18±2．20### 14．92±2．07### 2．72±0．24###龜羚帕安丸大劑量組 8 7．56±0．86###△＊＊＊▲▲▲ 41．20±5．13###△＊＊▲▲▲ 10．87±2．81###△△△＊＊＊▲▲▲ 3．91±0．59###△△△＊＊＊＊＊▲▲▲龜羚帕安丸中劑量組 8 10．61±1．57### 34．87±5．42### 18．56±2．40### 1．87±0．08###龜羚帕安丸小劑量組 8 18．08±2．36### 26．05±4．22### 30．37±2．83### 0．85±0．07###

3 討 論

帕金森病屬于中醫(yī)學(xué)“顫證”“震顫”的范疇。歷代醫(yī)家認為:該病病機多屬本虛標(biāo)實，本虛是肝腎陰虛，標(biāo)實為“瘀”“痰”“風(fēng)”互結(jié)、蘊塞腦竅。趙國華教授認為:該病的病理過程初期由實到虛;中期由虛致瘀，表現(xiàn)為虛實夾雜證候;后期為諸臟精血虛損，虛損互為因果，連鎖反應(yīng)過程。他提出了初期宜予以平肝熄風(fēng)以治標(biāo)，健脾益氣以治本;中期宜豁痰化瘀以治標(biāo)，滋補肝腎以治本;后期宜補益精血以治損的治療三法［4］。龜羚帕安丸是治療帕金森病的經(jīng)驗用方，方中龜板味甘性平，滋陰潛陽，補腎活血;羚羊角味咸性寒，平肝熄風(fēng);全蝎味咸性平，祛風(fēng)止痙通絡(luò);威靈仙味辛咸性溫，搜風(fēng)通絡(luò);厚樸味苦辛性溫，燥濕化痰。諸藥合用，共奏滋補肝腎、化痰活血之效。細胞凋亡是在體內(nèi)外因素的誘導(dǎo)下，由嚴格和復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控而發(fā)生的自主性細胞有序死亡過程，是機體維持細胞數(shù)量穩(wěn)定的重要手段。細胞凋亡調(diào)控異?？赡艹蔀槟承┘膊〉闹匾l(fā)病機制。［5］細胞凋亡的機制主要有興奮性氨基酸中毒、自由基損傷、鈣超載、調(diào)節(jié)基因(Bcl-2、Bax、P53、Fas、TNF-α)等表達失調(diào)。Mochizuki 等［6］通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生細胞凋亡，一些研究表明細胞凋亡參與了帕金森病的發(fā)病過程，曹非等［7］的實驗研究也證實了這一點。本實驗采用TUNEL 方法證實PD 大鼠模型黑質(zhì)損傷側(cè)呈現(xiàn)典型的黑質(zhì)凋亡細胞的存在，證實細胞凋亡參與了大鼠帕金森病的發(fā)病。黃月等［8］研究表明:6-OHDA 誘導(dǎo)黑質(zhì)細胞凋亡可能是通過誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)節(jié)Bcl-2 家族特別是Bcl-2 和Bax 的表達而導(dǎo)致的。Bc1-2 蛋白家族是哺乳動物細胞凋亡的重要調(diào)控因子，包括抗凋亡成分Bcl-2 和Bc1-x1 以及促凋亡成分Bax 等重要蛋白。李立宏等［9］通過實驗研究表明:Bcl-2 及Bax 的表達量及Bcl-2/Bax 的變化可以調(diào)節(jié)細胞死亡和存活間的平衡，決定著凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示:模型對照組與假手術(shù)組對比，Bcl-2 及Bax 升高，Bcl-2/Bax 比值降低，但以Bax 升高為主，說明Bcl-2 及Bax 都參與了細胞的凋亡，但以Bax 為主導(dǎo);龜羚帕安丸大、中、小劑量組和美多芭組與模型對照組對比，Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值都升高，Bax 降低，說明龜羚帕安丸可能主要是提高Bcl-2 的表達及Bcl-2/Bax 比值、抑制Bax 表達，從而具有保護神經(jīng)細胞的作用。

［1］常學(xué)輝，張良芝，李彥杰．龜羚帕安丸配合美多巴片治療帕金森病30 例療效觀察［J］．新中醫(yī)，2008，40(6):62－63．

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［4］李彥杰，李社宣．趙國華治療帕金森病經(jīng)驗［J］．光明中醫(yī)，2004，19(4):42－43．

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［6］Mochizuki H，Goto K，Mori H，et al．Histochemical detection of apoptosis in Parkinson＇s disease［J］．J Neurol Sci，1996，137(2):120－123．

［7］曹非，駱芳，段國安．大鼠帕金森病發(fā)病過程中黑質(zhì)細胞凋亡及其相關(guān)基因表達［J］．中國老年學(xué)雜志，2007，27(24):2369－2371．

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