基于液態(tài)黑脈羊肚菌菌絲體培養(yǎng)基配方的研究*

聶建軍，潘保華，李彩萍，徐全飛，牛 宇，張 博

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西 太原 030006;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030006;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038)

羊肚菌Morchella eulenta(L.)Pers.，屬子囊菌亞門(Abcmycotina)、盤菌目 (Peziales)、馬鞍菌科 (Helvellaceae)、羊肚菌屬 (Morehella)。具有降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗病毒、抑制腫瘤、減輕放化療引起的毒副作用等功效。羊肚菌屬共有28種，我國(guó)現(xiàn)有12種，主要分布于甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古、山西、河北、四川，云南等地。其中的佼佼者黑脈羊肚菌菌帽大、肉質(zhì)厚、菌柄短小、帽黑柄白、尖型飽滿、大小勻稱、氣味香濃，子實(shí)體中的鉀、鈣、鎂、鐵以及人體容易缺乏的微量元素鋅的含量非常高，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎。目前的技術(shù)還無法實(shí)現(xiàn)黑脈羊肚菌大規(guī)模的商業(yè)化栽培，而且野生資源極分散，數(shù)量非常少，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)有價(jià)無貨。據(jù)報(bào)道，羊肚菌菌絲體和子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分相差無幾，甚至菌絲體中賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等含量比子實(shí)體還高[1－4]。為了開發(fā)利用這一寶貴資源，筆者對(duì)黑脈羊肚菌菌絲體在液態(tài)環(huán)境中培養(yǎng)基配方進(jìn)行了研究，旨在為其菌絲體或相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

黑脈羊肚菌菌株Hm01，從采自山西省關(guān)帝山的野生子實(shí)體組織分離純化培養(yǎng)后所得。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

活化培養(yǎng)基[5]:CPDA培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB110 mg·L－1。

碳源培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖各2%及蛋白胨1%。

氮源培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鉀、硫酸銨、尿素、黃豆粉各1%及葡萄糖2%。玉米粉和黃豆粉加水煮沸30 min，5層紗布過濾。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與純化培養(yǎng)

將黑脈羊肚菌菌種從冰箱中取出后，25℃下恒溫放置3 d，使處于低溫中的菌種活化;無菌條件下把活化菌種接種于CPDA培養(yǎng)基平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)2 d～3 d之后挑取強(qiáng)壯菌絲前端，接種于斜面母種培養(yǎng)基上，25℃下恒溫培養(yǎng)至斜面長(zhǎng)滿，得實(shí)驗(yàn)用菌種備用。

1.3.2 碳 (氮)源篩選試驗(yàn)

挑取1 cm2實(shí)驗(yàn)用黑脈羊肚菌菌種，分別接種于6種不同碳 (氮)源培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝液體培養(yǎng)基100 mL，使氣生菌絲一面向上懸浮，25℃下靜置24 h;然后放入往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，26℃，140 r·min－1條件下培養(yǎng)6 d。每種碳 (氮)源試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 正交試驗(yàn)篩選液體培養(yǎng)基配方

把篩選出的最佳碳源、最佳氮源與 MgSO4·7H2O、KH2PO4組成正交試驗(yàn)9個(gè)不同處理的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同1.3.2，篩選出液體培養(yǎng)基最佳配方。每個(gè)處理重復(fù)5次，結(jié)果取平均值[6]。試驗(yàn)因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素及水平

1.4 測(cè)定方法

生物量的測(cè)定:取培養(yǎng)好的菌絲體液在3 000 r·min－1的條件下離心10 min，蒸餾水洗滌，再離心，倒去上清液，菌絲體在60℃下烘干至恒重，稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果

碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對(duì)黑脈羊肚菌菌絲體的影響

從表2可以看出，可溶性淀粉作為碳源，生長(zhǎng)的菌絲體呈淺黃色、絲狀，經(jīng)取樣、稀釋、鏡檢，菌液是由分布著數(shù)量巨大的斷裂菌絲體片段所組成的溶液，其菌絲體生物量最高，達(dá)9.85 g·L－1;對(duì)比其它5種碳源生成的菌絲體生物量差異達(dá)極顯著，因此，可溶性淀粉作為黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基碳源效果最佳，其次是玉米粉、葡萄糖等。

2.2 氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果

氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對(duì)黑脈羊肚菌菌絲體的影響

從表3可以看出，有機(jī)氮源優(yōu)于無機(jī)氮源，但尿素不能被很好地利用。酵母浸膏作為有機(jī)氮源，生成的菌絲體呈淺褐色、絲狀，其菌絲體生物量最高，達(dá)8.34 g·L－1，對(duì)比其它5種氮源生成的菌絲體生物量差異達(dá)極顯著，因此，酵母浸膏作為黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基氮源效果最佳，其次是黃豆粉、蛋白胨等。

2.3 正交試驗(yàn)篩選黑脈羊肚菌液體培養(yǎng)基結(jié)果

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表4。

表4 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4可以得出，影響黑脈羊肚菌菌絲體生物量的因素依次為A＞D﹥B﹥C，即可溶性淀粉﹥MgSO4·7H2O﹥酵母浸膏﹥KH2PO4;黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基最佳組合為A2B1C3D2，即可溶性淀粉3%、酵母浸膏0.5%、KH2PO40.3% 、MgSO4·7H2O 0.1% 。

3 結(jié)論

通過篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基最佳碳源是可溶性淀粉，最佳氮源是酵母浸膏?？扇苄缘矸圩鳛楹诿}羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基的碳源，一方面可以作為碳營(yíng)養(yǎng)被吸收和利用，另一方面前期可以作為增稠劑來提高培養(yǎng)液黏度，增加菌絲體數(shù)量，到后期可溶性淀粉被消耗而使培養(yǎng)液變稀，這樣的菌種接到固體培養(yǎng)基上透氣性好，有利于菌種萌發(fā)和吃料。

采用正交試驗(yàn)方法篩選黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明，黑脈羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)基最佳配方為可溶性淀粉 3%、酵母浸膏 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.3%、VB110 mg·L－1。

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