東方明珠楊梅揮發(fā)油成分及抗腫瘤活性研究

劉濤+彭志軍+金吉芬+羅歡+范建新+羅福賢

摘要：采用水蒸氣蒸餾法提取東方明珠楊梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）揮發(fā)油，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法對其化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定，使用MTT法研究揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549體外增殖的抑制活性。從東方明珠楊梅的揮發(fā)油中鑒定出33個化合物，已鑒定組分占揮發(fā)油總量的93.76%，包括棕櫚酸（13.99%）、石竹烯（11.82%）、角鯊烯（6.17%）、β-谷甾醇（5.39%）、2， 2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%）、2， 4-二叔丁基-5-甲基苯酚（4.28%）、二十七烷（4.15%）、二十九烷（4.11%）、三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）等。該揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞的體外增殖具有較好的抑制作用，并與濃度呈正相關(guān)。結(jié)果表明，東方明珠楊梅揮發(fā)油中含有烷烴類、有機(jī)酸類、酯類萜類、醇類、酚類、甾體類等多種成分，并表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，為其深層次的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：東方明珠楊梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）；揮發(fā)油；氣質(zhì)聯(lián)用；抗腫瘤

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4418-04

楊梅（Myrica rubra Sieb. et Zucc.）屬楊梅科（Myricaceae），原產(chǎn)于中國的亞熱帶，世界上有60多種，中國有6種[1-4]。楊梅為藥食兩用的芳香植物[5]，宋代《食療本草》和明代《本草綱目》中對楊梅的藥用功效均有記載[6]。楊梅枝葉和根皮在中國大陸、臺灣地區(qū)和日本等地常用作收斂劑、解毒劑和腸胃止瀉劑等[7]。其主要活性成分黃酮類化合物具多種藥理活性[8]，如楊梅葉中的楊梅素、槲皮素等均具有抗氧化作用、清除體內(nèi)活性氧自由基功能，同時還具有降血壓、抗炎、抑菌、抗氧化活性等多種功效，藥用價值較高[9]。東方明珠楊梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）是浙江省衢縣名特優(yōu)經(jīng)濟(jì)林良種繁育中心培育出的經(jīng)濟(jì)性狀和生長特性優(yōu)良且穩(wěn)定的東魁2號，2001年通過浙江省林木良種審定，定名為東方明珠楊梅[10]。

揮發(fā)油亦稱精油，是存在于植物體內(nèi)的一類具有芳香氣味、常溫下能揮發(fā)的油狀成分[11-13]。揮發(fā)油作為次生代謝物，是植物體抵御致病菌侵害的重要物質(zhì)，絕大多數(shù)植物揮發(fā)油具有優(yōu)良的體外抗真菌作用[14-16]。目前，東方明珠楊梅的揮發(fā)油化學(xué)成分及生物活性的研究還未見報(bào)道。該試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取東方明珠楊梅果實(shí)揮發(fā)油，使用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法對其化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定，同時采用MTT法研究其抗腫瘤生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東方明珠楊梅果實(shí)由貴州省荔波縣甲良楊梅基地提供，于2013年6月采摘同株樹上成熟度一致的果實(shí)，剔除爛果。

RPMI 1640培養(yǎng)基（美國GIBICO公司）；胰蛋白酶（美國SIGMA公司）；MTT和SDS（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司）。

胃癌細(xì)胞株MGC-803、乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37、前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3以及肺癌細(xì)胞株A549購自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；滅菌鍋YXQ-LS-50（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；旋渦混合器XW-80A（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；胎牛血清（FBS）（天津市灝陽生物制品科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)油的提取 將新鮮東方明珠楊梅去皮、去子，陰涼處風(fēng)干后，用水蒸氣蒸餾法提取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后得淺黃色油狀揮發(fā)油。

1.3.2 色譜條件 HP-5 MS 5% phenyl Methyl Siloxane（0.25 μm×0.25 mm×30 m）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫以50 ℃起始，并以5 ℃/min升溫到280 ℃，保持10 min；氣化室溫度250 ℃，載氣為高純He （99.999%），載氣流量1.5 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL（用將樣品稀釋的溶液），不分流。

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源為EI源，離子源溫度為280 ℃，電子能量是70 eV，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲2 min，質(zhì)量范圍40～550 amu。

1.3.4 抗腫瘤活性測試 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%（m/V）胰蛋白酶消化后，重懸于含10%（V/V） FBS的RPMI 1640的培養(yǎng)基中，以2×104 mL的終濃度接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%（V/V）CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后吸掉培養(yǎng)基，加入含不同濃度樣品的有血清培養(yǎng)基，每孔200 μL。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后吸取含藥培養(yǎng)基，加入濃度為0.5 mg/mL的MTT，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后每孔再補(bǔ)加100 μL 10%（m/V）SDS，放入培養(yǎng)箱10 h，使結(jié)晶充分溶解后取出，冷卻至室溫，在595 nm下測OD值，計(jì)算抑制率。同時設(shè)空白對照組、陰性對照組和陽性對照組?？瞻讓φ战M不加細(xì)胞只加有血清RPMI1640培養(yǎng)基，陰性對照組加入與藥物同體積的二甲亞砜，陽性對照組加入與被測藥物同濃度的阿霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油成分分析

東方明珠楊梅揮發(fā)油的總離子流圖如圖1所示?？傠x子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后所得的質(zhì)譜圖，采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索（NIST數(shù)據(jù)庫），人工譜圖解析，按各峰的質(zhì)譜裂片與文獻(xiàn)核對，查對有關(guān)質(zhì)譜資料、質(zhì)核比和相對豐度等方面進(jìn)行比較核對，東方明珠楊梅揮發(fā)油分析結(jié)果如表1所示。endprint

由圖1可知，從樣品中分離出57個組分，鑒定出33個（表1），包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，鑒定成分占總揮發(fā)油成分的93.76%?？倱]發(fā)油成分中有10種化合物含量超過總量的3%，分別為：棕櫚酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鯊烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗腫瘤生物活性測試

將東方明珠楊梅揮發(fā)油倍比稀釋成不同濃度，以胃癌細(xì)胞（MGC-803）、乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37）、前列腺癌細(xì)胞（PC3）和肺癌細(xì)胞（A549）為對象，使用MTT法分析其體外抗腫瘤生物活性（3次重復(fù)），結(jié)果見表2。

由表2可以看出，東方明珠楊梅揮發(fā)油具有較明顯的腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制活性，隨著濃度逐步加大，抑制率逐漸升高，揮發(fā)油對各細(xì)胞系的IC50值見圖2。

從圖2可以得出，東方明珠楊梅揮發(fā)油對Bcap-37細(xì)胞的體外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3細(xì)胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇還具有較好的抗腫瘤作用，可抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化，對腫瘤細(xì)胞具有抗增殖活性與可激活鞘磷脂循環(huán)、細(xì)胞周期阻滯、刺激腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的調(diào)節(jié)等[17，18]。同時據(jù)報(bào)道，揮發(fā)油中的角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[19]。因此，揮發(fā)油中的甾體和萜類物質(zhì)可能是其中的主要活性因子。

3 小結(jié)

該試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取東方明珠楊梅果實(shí)的揮發(fā)油，并使用GS-MS法分析了其化學(xué)成分，鑒定了33個化學(xué)成分，包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，占總揮發(fā)油成分的93.76%。揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的體外增殖具有較好的抑制作用，研究表明，東方明珠楊梅具有一定的藥用價值。該研究為深入開發(fā)利用相關(guān)資源提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

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[17] 王 莉，歸綏琪.β-谷甾醇抗腫瘤作用研究[J].國際腫瘤雜志， 2009，36（9）：676-679.

[18] 李慶勇，姜春菲，張 黎，等.β-谷甾醇、豆甾醇誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（5）：1173-1175.

[19] 榮維廣，劉華良，李 莉，等.超高效液相色譜法測定保健食品中角鯊烯[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2013，29（8）：734-736.endprint

由圖1可知，從樣品中分離出57個組分，鑒定出33個（表1），包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，鑒定成分占總揮發(fā)油成分的93.76%?？倱]發(fā)油成分中有10種化合物含量超過總量的3%，分別為：棕櫚酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鯊烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗腫瘤生物活性測試

將東方明珠楊梅揮發(fā)油倍比稀釋成不同濃度，以胃癌細(xì)胞（MGC-803）、乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37）、前列腺癌細(xì)胞（PC3）和肺癌細(xì)胞（A549）為對象，使用MTT法分析其體外抗腫瘤生物活性（3次重復(fù)），結(jié)果見表2。

由表2可以看出，東方明珠楊梅揮發(fā)油具有較明顯的腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制活性，隨著濃度逐步加大，抑制率逐漸升高，揮發(fā)油對各細(xì)胞系的IC50值見圖2。

從圖2可以得出，東方明珠楊梅揮發(fā)油對Bcap-37細(xì)胞的體外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3細(xì)胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇還具有較好的抗腫瘤作用，可抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化，對腫瘤細(xì)胞具有抗增殖活性與可激活鞘磷脂循環(huán)、細(xì)胞周期阻滯、刺激腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的調(diào)節(jié)等[17，18]。同時據(jù)報(bào)道，揮發(fā)油中的角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[19]。因此，揮發(fā)油中的甾體和萜類物質(zhì)可能是其中的主要活性因子。

3 小結(jié)

該試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取東方明珠楊梅果實(shí)的揮發(fā)油，并使用GS-MS法分析了其化學(xué)成分，鑒定了33個化學(xué)成分，包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，占總揮發(fā)油成分的93.76%。揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的體外增殖具有較好的抑制作用，研究表明，東方明珠楊梅具有一定的藥用價值。該研究為深入開發(fā)利用相關(guān)資源提供了參考。

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[8] 黃巧珍，趙東海，裘觀榮，等.楊梅葉總黃酮類化合物抗抑郁活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：49-50.

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[12] 王紅濤.肉桂揮發(fā)油的提取與應(yīng)用研究[J].北京農(nóng)業(yè)，2012（36）：86.

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[16] 刁銀軍，許玲玲，麻佳蕾，等.GC-MS聯(lián)用分析三個品種楊梅樹葉的揮發(fā)油組分[J].化學(xué)分析計(jì)量，2009，18（1）：25-28.

[17] 王 莉，歸綏琪.β-谷甾醇抗腫瘤作用研究[J].國際腫瘤雜志， 2009，36（9）：676-679.

[18] 李慶勇，姜春菲，張 黎，等.β-谷甾醇、豆甾醇誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（5）：1173-1175.

[19] 榮維廣，劉華良，李 莉，等.超高效液相色譜法測定保健食品中角鯊烯[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2013，29（8）：734-736.endprint

由圖1可知，從樣品中分離出57個組分，鑒定出33個（表1），包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，鑒定成分占總揮發(fā)油成分的93.76%?？倱]發(fā)油成分中有10種化合物含量超過總量的3%，分別為：棕櫚酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鯊烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗腫瘤生物活性測試

將東方明珠楊梅揮發(fā)油倍比稀釋成不同濃度，以胃癌細(xì)胞（MGC-803）、乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37）、前列腺癌細(xì)胞（PC3）和肺癌細(xì)胞（A549）為對象，使用MTT法分析其體外抗腫瘤生物活性（3次重復(fù)），結(jié)果見表2。

由表2可以看出，東方明珠楊梅揮發(fā)油具有較明顯的腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制活性，隨著濃度逐步加大，抑制率逐漸升高，揮發(fā)油對各細(xì)胞系的IC50值見圖2。

從圖2可以得出，東方明珠楊梅揮發(fā)油對Bcap-37細(xì)胞的體外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3細(xì)胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇還具有較好的抗腫瘤作用，可抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化，對腫瘤細(xì)胞具有抗增殖活性與可激活鞘磷脂循環(huán)、細(xì)胞周期阻滯、刺激腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的調(diào)節(jié)等[17，18]。同時據(jù)報(bào)道，揮發(fā)油中的角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[19]。因此，揮發(fā)油中的甾體和萜類物質(zhì)可能是其中的主要活性因子。

3 小結(jié)

該試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取東方明珠楊梅果實(shí)的揮發(fā)油，并使用GS-MS法分析了其化學(xué)成分，鑒定了33個化學(xué)成分，包括烷烴、有機(jī)酸、酯類萜、醇、酚、甾體等化合物，占總揮發(fā)油成分的93.76%。揮發(fā)油對腫瘤細(xì)胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的體外增殖具有較好的抑制作用，研究表明，東方明珠楊梅具有一定的藥用價值。該研究為深入開發(fā)利用相關(guān)資源提供了參考。

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