蓖麻粕中蓖麻堿的微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抑菌性*

許偉，柯增光，，顏秀花，邵 榮，云志

1(鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城，224051)2(南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京，210009)

蓖麻為大戟科蓖麻屬植物，是世界十大油料作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛種植［1］。我國是世界第二大蓖麻生產(chǎn)國［2］。蓖麻籽經(jīng)過壓榨出油后得到的殘?jiān)礊楸吐槠?。蓖麻粕中含有豐富的蛋白和天然活性物質(zhì)，其中的蓖麻堿［3］具有殺蟲［4］、保肝［5］、鎮(zhèn)痛［6，7］等作用;此外，蓖麻堿還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用，低劑量時(shí)對(duì)記憶具有一定的改善效果，較大劑量時(shí)致驚厥，可作為工具藥制備癲癇動(dòng)物模型篩選抗驚厥藥［8］。長期以來，蓖麻粕還只是作為肥料用于農(nóng)田，效益低下［9］。蓖麻粕的有效開發(fā)利用對(duì)推動(dòng)蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展、創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益具有積極作用。本研究采用微波輔助法從蓖麻粕中提取蓖麻堿，通過響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取工藝，并初步研究了蓖麻堿的抑菌性，以期為蓖麻堿的高效開發(fā)、拓寬利用途徑提供一些基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，都由鹽城工學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)中心提供;蓖麻籽，購自河北省安國市華仁藥材有限公司。

甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、石油醚(分析純)，購自江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司;無水乙醚(分析純)、三氯甲烷(分析純)，購自南京化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)，購自美國天地公司;蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-80電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;752紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器有限公司;XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐生物科技有限公司;P230Ⅱ高效液相色譜，大連依利特有限公司;AUY220電子天平，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蓖麻粕制備

將蓖麻籽粉碎，加入V(乙醚)∶V(石油醚)=3∶1的混合溶劑，固液比為1∶3(g∶mL)，機(jī)械攪拌1h，將固-液混合物進(jìn)行分離，干燥后得到脫脂蓖麻粕。

1.3.2 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取25 mg蓖麻堿純品，甲醇溶解定容在25 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確吸取上述溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分別定容在10 mL的容量瓶中，高效液相色譜法測(cè)峰面積。以蓖麻堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蓖麻粕中蓖麻堿含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蓖麻粕20 g，按1∶10(g∶mL)的料液比加入蒸餾水，在微波功率400 W下提取5 min，過濾，濾液濃縮至膏狀，轉(zhuǎn)移至索氏抽提器中，加入三氯甲烷150 mL，在90℃下回流提取3 h，蒸出溶劑，甲醇充分溶解并定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜分析，記錄峰面積。將分離得到的蓖麻粕重復(fù)上述操作，直至峰面積小于500 mV·sec，將所有峰面積相加，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到蓖麻堿的質(zhì)量濃度c，然后根據(jù)下式計(jì)算蓖麻堿含量。

式中:y為蓖麻堿含量，%;c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的待測(cè)蓖麻堿質(zhì)量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 蓖麻堿提取率計(jì)算

式中:η為蓖麻堿提取率，%;c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的待測(cè)蓖麻堿質(zhì)量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g;y為蓖麻堿含量，%。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以蓖麻堿提取率作為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)分別研究微波功率(100，200，300，400，500，600 W)、液固比(2，4，6，8，10，12 mL/g)和提取時(shí)間(1，2，3，4，5，6 min)對(duì)蓖麻堿提取率的影響，初步確定適宜提取蓖麻堿的相應(yīng)水平范圍。每個(gè)處理3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取微波功率、液固比和提取時(shí)間3個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化蓖麻堿提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素和水平表設(shè)計(jì)見表1。每個(gè)處理平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0軟件進(jìn)行分析。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 蓖麻堿的抑菌性研究

1.3.5.1 菌種的活化及菌懸液的制備［10］

將3種供試菌分別接入到已滅菌的斜面上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別挑取一環(huán)已活化好的菌種接種到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)搖床(160 r/min、37℃)中培養(yǎng)12 h，然后用無菌生理鹽水將3種菌稀釋至濃度約5×106～5×107CFU/mL的菌懸液。

1.3.5.2 抑菌性實(shí)驗(yàn)

蓖麻堿的抑菌性實(shí)驗(yàn)采用參考文獻(xiàn)［11－12］中的方法并略作修改。取直徑為6 mm的濾紙片于121℃、0.1 MPa下濕熱滅菌20 min備用。將已滅菌的濾紙片分別放入濃度為10、5和2.5 mg/mL的蓖麻堿溶液中浸泡30 min。將每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入15 mL已滅菌的固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，各取供試菌液0.2 mL分別涂布在固體培養(yǎng)基上，制成含菌平板，每種菌的平板貼3片浸過不同濃度的蓖麻堿溶液的濾紙片和1片浸過生理鹽水的濾紙片，對(duì)稱放置。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值，比較蓖麻堿對(duì)各種菌的抑菌性。每種菌做3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蓖麻堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=21 654.48x+666.08，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 蓖麻堿含量測(cè)定

重復(fù)測(cè)定3次，蓖麻堿含量平均值為0.164 1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.38%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。

表2 蓖麻堿含量測(cè)定Table 2 Ricinine content determination

2.3 微波輔助提取蓖麻堿的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 微波功率對(duì)蓖麻堿提取率影響

微波功率對(duì)蓖麻堿提取率的影響見圖1。

圖1 微波功率對(duì)蓖麻堿提取率影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of ricinine

由圖1可以看出，當(dāng)微波功率較小時(shí)，隨著微波功率的增加，蓖麻堿的提取率上升，當(dāng)微波功率達(dá)到400 W后，蓖麻堿的提取率開始下降?？赡苁请S著微波功率增加，微波的熱效應(yīng)增強(qiáng)，提取液的溫度升高，增加了固液擴(kuò)散速度，提高了提取率;但是當(dāng)功率過大，使升溫速度過快，可能導(dǎo)致提取液爆沸，造成了提取液的損失，而且功率增加也會(huì)增加能耗［13］。因此最適的微波功率為400 W。

2.3.2 液固比對(duì)蓖麻堿提取率影響

液固比對(duì)蓖麻堿提取率的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著液固比的增加，蓖麻堿提取率逐漸上升，液固比超過10后，蓖麻堿提取率幾乎不發(fā)生變化?？赡苁且?yàn)槿軇┝吭龃蠛?，濃度梯度變大，有利于蓖麻堿的溶出;液固比超過10后，再增加液固比，蓖麻堿的提取率也不再增加，表明提取已達(dá)到平衡［14］。因此最適的液固比為10。

圖2 液固比對(duì)蓖麻堿提取率影響Fig.2 Effect of material to solvent on the extraction rate of ricinine

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率影響

提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的影響見圖3。由圖3可以看出，隨著微波提取時(shí)間的延長，蓖麻堿提取率逐漸提高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)，蓖麻堿的提取率達(dá)到最大值，再延長提取時(shí)間，蓖麻堿提取率開始下降?？赡苁请S著提取時(shí)間的不斷延長，環(huán)境溫度不斷上升，促進(jìn)了溶質(zhì)的浸出，當(dāng)提取時(shí)間超過5 min時(shí)，環(huán)境溫度過高，使溶劑沸騰，溶劑量減少，溫度過高也可能導(dǎo)致蓖麻堿分解［15］。因此最適的提取時(shí)間為5 min。與傳統(tǒng)提取方法［16］(熱水提取時(shí)間一般為3～4 h)相比，微波提取法顯著縮短了蓖麻堿的提取時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。運(yùn)用 Design Expert8.0軟件對(duì)表3中的17個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合后得到關(guān)于微波功率(W)、液固比(mL/g)和提取時(shí)間(min)的二次多項(xiàng)式回歸模型為:

蓖麻堿提取率Y%=49.10+0.14 X1+2.53 X2－0.44 X3+0.66 X1X2－2.83 X1X3+1.29 X2X3－

圖3 提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of ricinine

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiment

該回歸模型及模型系數(shù)顯著性驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該模型極其顯著(P值＜0.000 1)，決定系數(shù)R2值為0.998 3，表明該模型蓖麻堿提取率的實(shí)驗(yàn)值和擬合值之間具有很好的擬合度。該模型的失擬項(xiàng)P值＞0.10，表明二次模型是合適的。對(duì)模型系數(shù)顯著性分析可知，因素X1對(duì)蓖麻堿提取率的影響不顯著，X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X2和X2對(duì)蓖麻堿提取率的影響顯著。因素的P值越小，對(duì)蓖麻堿提取率的影響越顯著。一次項(xiàng)中各因素對(duì)蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時(shí)間(X3)＞微波功率(X1)。

2.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中各因素交互作用影響

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中液固比和微波功率對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖4。從圖4可以看出，提取時(shí)間處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達(dá)到穩(wěn)定。

圖4 微波功率和液固比對(duì)蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of microwave power，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中微波功率和提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖5。

圖5 微波功率和提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of microwave power，solvent-to-material extraction time on the extraction rate of ricinine

從圖5可以看出，液固比處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著提取時(shí)間的延長先升高后降低。

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中液固比和提取時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖6。從圖6可以看出，微波功率處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著提取時(shí)間的延長先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達(dá)到穩(wěn)定。

圖6 提取時(shí)間和液固比對(duì)蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of extraction time，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

2.4.3 回歸模型驗(yàn)證

經(jīng)過Box-Behnken設(shè)計(jì)得到微波提取蓖麻堿最優(yōu)工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時(shí)間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下蓖麻堿的提取率為50.74%。

考慮到實(shí)際操作的便利，將蓖麻堿的最優(yōu)工藝條件修正為:微波功率408 W，提取時(shí)間5.2 min，液固比12(mL∶g)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到蓖麻堿的提取率為50.81%，相對(duì)偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。

2.5 蓖麻堿抑菌性結(jié)果

蓖麻堿對(duì)各種菌的抑菌作用見圖7。由圖7可知，蓖麻堿對(duì)大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，且隨著蓖麻堿的濃度增加而增強(qiáng)。蓖麻堿對(duì)各菌種的抑菌效果為:大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

圖7 蓖麻堿對(duì)各種菌種的抑菌作用Fig.7 Antibacterial activity of ricinine on different strains

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蓖麻粕為原料，以水為提取溶劑，采用微波輔助提取蓖麻堿，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化了蓖麻堿提取工藝，得到微波提取蓖麻堿的最佳工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時(shí)間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下獲得蓖麻堿提取率的理論值為50.74%，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際提取率為50.81%，相對(duì)偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。通過方差性分析可知各因素對(duì)蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時(shí)間(X3)＞微波功率(X1)。采用微波輔助提取法具有比傳統(tǒng)提取方法時(shí)間短的特點(diǎn)。采用濾紙片法測(cè)定蓖麻堿的抑菌性，結(jié)果表明蓖麻堿對(duì)大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，蓖麻堿對(duì)各菌種的抑菌效果為大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

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