青風(fēng)藤醇提物與青藤堿治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠藥效的比較研究*

姚 瑤，葛衛(wèi)紅

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見的以侵犯滑膜關(guān)節(jié)為主的炎性自身免疫病，其發(fā)病機制復(fù)雜，病變過程涉及多種細胞。青風(fēng)藤，拉丁名Sinomenium acutum，是防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤莖[1]，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)等作用，臨床主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病。青風(fēng)藤中包括如青藤堿（sinomenine，SIN）、 小 檗 堿 （berberine）、 青 風(fēng) 藤 定 堿（sinomendine）等。青藤堿在青風(fēng)藤中含量最多，高達2%[2]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，目前有青藤堿片和緩釋片兩種劑型在臨床使用，治療RA有效，可以一定程度地緩解關(guān)節(jié)炎癥和抑制骨破壞。與此同時，其他一些成分也有鎮(zhèn)痛、抗炎抗風(fēng)濕成分以及免疫抑制的作用，都有可能對RA起到相關(guān)治療作用[3]，如小檗堿是一種異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用，包括抗發(fā)炎。李宇馨等[4]研究表明，小檗堿通過抑制小鼠PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎和鎮(zhèn)痛作用。Jeong等[5]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在巨噬細胞通過激活磷酸腺苷酶 （amp-activated protein kinase，AMPK）來抑制炎癥反應(yīng)。青風(fēng)藤與青藤堿單體對RA治療作用的比較鮮見報道。本研究考察和比較青風(fēng)藤醇提物與青藤堿單體對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級健康Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，雌性，體質(zhì)量150～170 g，由浙江省實驗動物中心提供，生產(chǎn)批號：scxk （浙）2008-0033，南京市鼓樓醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后開始用于實驗。

1.2 試材與試劑

青風(fēng)藤干燥藤莖（產(chǎn)于浙江，購于南京藥業(yè)股份有限公司，批號：101028，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為防己科植物青藤藤莖）；正清風(fēng)痛寧片（湖南正清藥業(yè)有限公司，批號：0907101）；天然牛Ⅱ型膠原蛋白（批號：C-7806）；完全弗氏佐劑（批號：C-9007）；IL-17酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 （批號：10090913）、RANKL酶聯(lián)免疫吸附測定 （批號：10090909）、OPG酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 （批號：10090913），均購于美國Sigma公司。所用化學(xué)試劑均為色譜純；實驗用水為超純水。

1.3 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀及附件；ELx800吸收光酶標儀，美國BioTek公司產(chǎn)品。

1.4 色譜條件

色譜柱為 ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（用磷酸及三乙胺調(diào)整pH至7.8）-乙腈（40∶60）；柱溫為 30；流速為 1.0 mL·min-1；檢測波長為 262 nm；進樣量 20 μL。

1.5 試藥的制備

青風(fēng)藤干燥藤莖粉碎，12倍藥量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濃縮液，回收膏狀溶劑，每毫升相當于生藥50 g，加水稀釋，使青風(fēng)藤醇提物混懸液含2 mg·mL-1生藥。正清風(fēng)痛寧片研磨，加入適量乙醇，溶解，再加水制成2 mg·mL-1青藤堿的混懸液。

1.6 大鼠關(guān)節(jié)炎模型的制備

50只大鼠稱體重后，隨機分為對照組10只以及造模組40只。將溶于醋酸的Ⅱ型膠原蛋白先于4℃低溫保存過夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對模型組大鼠背部及尾部多點行皮下注射，誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，每只大鼠0.15 mL，7 d后進行第二次注射，方法與首次注射相同。對照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.7 關(guān)節(jié)評分

關(guān)節(jié)腫脹評分標準：關(guān)節(jié)處無腫脹，0分；趾關(guān)節(jié)微腫，1分；趾關(guān)節(jié)及足趾處發(fā)生腫脹現(xiàn)象，2分；踝關(guān)節(jié)以下的足爪發(fā)生腫脹現(xiàn)象，3分；全部足爪腫脹（包括踝關(guān)節(jié)），4分。大鼠最終分數(shù)為四肢關(guān)節(jié)腫脹分數(shù)總和，最高分為16分。首次免疫注射后每3天稱重1次，每次固定兩名實驗員記錄關(guān)節(jié)腫脹評分（arthritis index，AI）[6]。

1.8 分組與給藥

造模第21天關(guān)節(jié)評分，AI＞4的認定為造模成功。其中8只未成模棄用，32只成模大鼠又隨機分為模型組（n=12）和青風(fēng)藤組、青藤堿組（n=10）。 開始給藥：青風(fēng)藤組灌胃給予青風(fēng)藤醇提液，使青藤堿為 10 mg·kg－1·d－1；青藤堿組灌胃給予青藤堿的混懸液，使青藤堿為 10 mg·kg－1·d－1；模型組與對照組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；持續(xù)36 d。

1.9 炎癥因子測定

實驗結(jié)束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA法測定血清中白介素-17（interleukin-17，IL-17）、NF-κB 配位體受體活化劑（receptor or activator of NF-KB ligand，RANKL）以及可溶性蛋白骨保護素（osteoprotegerin，OPG）水平，按試劑盒說明書操作。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 青風(fēng)藤中青藤堿含量測定

在“1.4”色譜條件下，青藤堿得到較好的分離，無明顯干擾峰出現(xiàn)，保留時間約為6.9 min，色譜圖見圖 1-A。 回歸方程為：Y=19.836X+684.45，r2=0.9989，最低檢測濃度0.12 mg·L-1。青藤堿的青風(fēng)藤乙醇回流冷凝提取，醇提液超速離心15 min，上清液按照“1.4”色譜條件進樣，色譜圖見圖1-B。根據(jù)醇提液中的青藤堿含量計算每百克生藥中青藤堿的含量，青風(fēng)藤中的青藤堿含量約為2%，與文獻報道一致。繼而用適量青風(fēng)藤制成醇提液，濃縮成膏狀，加入純化水稀釋，制成青藤堿含量為2 g·mL-1的混懸液。

圖1 青藤堿色譜圖（A）與青風(fēng)藤色譜圖（B）

2.2 大鼠關(guān)節(jié)評分

成模大鼠關(guān)節(jié)急性期表現(xiàn)為紅、腫，以對稱性后肢關(guān)節(jié)為著，累及踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、趾間關(guān)節(jié)等，關(guān)節(jié)癥狀一般自后足首發(fā)，癥狀呈進行性加重，后肢在初次免疫后20 d左右出現(xiàn)第一個炎癥高峰，即刻開始給藥，每3天記錄關(guān)節(jié)評分，見圖2。藥物治療后，大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，在整個治療過程中呈顯著下降趨勢，而模型組大鼠關(guān)節(jié)炎評分一直居高不下，在第35天再次達峰，提示關(guān)節(jié)炎進入慢性狀態(tài)。治療結(jié)束第58天，模型組（model）大鼠關(guān)節(jié)評分高至7.5分，大鼠消瘦且皆蜷縮于角落，畏寒、足腫脹嚴重，而青風(fēng)藤醇提物組 （QFT）和青藤堿組（SIN）大鼠均得到不同程度的緩解，見圖3。且青風(fēng)藤醇提物組關(guān)節(jié)炎評分低于青藤堿組（P＜0.05）。

圖2 實驗中各組大鼠AI變化趨勢

圖3 第58天模型組與治療組的AI比較

2.3 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG測定

青風(fēng)藤醇提物組IL-17、RANKL水平顯著低于模型組（P＜0.05），但未能降低到對照組水平；青藤堿組IL-17、RANKL未能得到很好的控制，與模型組無顯著差異（P＞0.05）；青風(fēng)藤醇提物組RANKL水平顯著低于青藤堿組（P＜0.05）。青藤堿組和青風(fēng)藤醇提物組OPG水平顯著高于模型組（P＜0.05），其中青藤堿組OPG水平與正常組相比無顯著性差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

注：*表示與模型組比較P＜0.05， ＆ 表示與青藤堿組比較P＜0.05

組別 n IL-17 RANKL OPG對照模型青風(fēng)藤醇提物青藤堿10 12 10 10 221.05±82.76*574.53±72.37 412.28±95.21* ＆ 544.79±81.23 126.76±37.85*202.16±20.16 167.44±14.68* ＆ 238.53±47.82 67.20±5.58*38.14±8.03 51.55±7.22*67.52±6.65*

3 討 論

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型由Trentham[7]于1977年首次報道，該模型經(jīng)常用于研究治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，本研究應(yīng)用該模型探討傳統(tǒng)中藥的醇提物與其有效單體在大鼠體內(nèi)藥效的差異。實驗結(jié)果提示，青風(fēng)藤醇提物與青藤堿均能有效緩解膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎腫脹，并且能夠恢復(fù)關(guān)節(jié)功能；而青風(fēng)藤醇提物能夠有效降低IL-17、RANKL的分泌，提高OPG的水平；青藤堿對IL-17、RANKL的作用不顯著，卻能顯著提高OPG水平。

IL-17是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，由Th17細胞分泌產(chǎn)生，可以刺激成纖維細胞、角質(zhì)細胞、上皮及內(nèi)皮細胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E2（PGE2）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP等，還可誘導(dǎo)人成纖維細胞表達細胞間粘附分子（ICAM-1）, 促進T細胞增殖[8]。然而，目前并未有研究指出青藤堿能夠直接抑制Th17的分泌，Yan LC等的研究表明，青藤堿低劑量時不能發(fā)揮其抗炎作用，反而青藤堿的一類衍生物能夠顯著抑制Th17的表達，從而減少IL-6、TNF-α的分泌，調(diào)節(jié)免疫。這與本研究結(jié)果類似，同時推測青風(fēng)藤醇提物中是否存在與青藤堿結(jié)構(gòu)類似的衍生物，能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用，有待進一步研究[9]。

類風(fēng)濕慢性炎癥的結(jié)果是骨破壞，最終致殘，青藤堿與青風(fēng)藤醇提物均能有效提高OPG水平，青風(fēng)藤醇提物能夠顯著抑制RANKL的分泌。OPG與RANKL競爭性地結(jié)合到破骨細胞前體細胞的RANK上，抑制破骨細胞的活化。破骨細胞是RA骨破壞進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞。RANKL來源于位于滑膜內(nèi)膜層的成纖維樣滑膜細胞 （fibroblastlike synoviocytes，F(xiàn)LS），它在RA病變中異?；罨墙閷?dǎo)滑膜局部炎癥的關(guān)鍵細胞之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)它也是參與關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細胞[10]。本研究提示，青風(fēng)藤醇提物和青藤堿均能通過改善RANKL/OPG的比值有效抑制骨破壞，青風(fēng)藤醇提物的作用可能更為顯著。Chen DP的研究表明，青藤堿能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1在正常FLS與RA-FLS的表達，抑制IL-6分泌[11]。Ou Y的研究提示，青藤堿能夠抑制RA-FLS的侵襲，并且降低MMPs的分泌，保護軟骨和骨[12。

總之，青藤堿能夠提高OPG水平，而青風(fēng)藤醇提物對RANKL、IL-17分泌的抑制作用優(yōu)于青藤堿，且青風(fēng)藤醇提物中的系列生物堿成分的結(jié)構(gòu)相似，都具有菲核結(jié)構(gòu)，提示青風(fēng)藤醇提物中可能存在其他青藤堿類似物，也能發(fā)揮抗炎抗骨破壞的作用，青風(fēng)藤醇提物成分分析和具體機制仍有待進一步研究。

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