KATP通道開(kāi)放劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖表達(dá)及SOCS3/5免疫失衡的影響

鄧伊++王志強(qiáng)

[摘要] 目的 研究ATP敏感性鉀通道（KATP通道）開(kāi)放劑對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）增殖過(guò)程的影響，以及細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表達(dá)變化與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）分泌釋放水平的關(guān)系。 方法 體外構(gòu)建增殖型ASMCs原代培養(yǎng)細(xì)胞模型，分為ASMCs組、AngⅡ·ASMCs組、淋巴細(xì)胞（L）組、ASMCs+L組和AngⅡ·ASMCs+L組。Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表達(dá)的差異；ELISA法檢測(cè)上清液中TGF-β1的釋放水平。觀察KATP通道開(kāi)放劑尼可地爾（NCR）干預(yù)的影響。 結(jié)果 與ASMCs組比較，AngⅡ·ASMCs組TGF-β1的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；NCR作用于細(xì)胞后各組ASMCs表達(dá)TGF-β1與格列本脲（GLI）比較明顯減少（P<0.05）。與ASMCs+L組比較，AngⅡ·ASMCs+L組SOCS3 mRNA表達(dá)增加，而SOCS5 mRNA表達(dá)減少（P<0.05）。NCR可以下調(diào)SOCS3的表達(dá)，上調(diào)SOCS5的表達(dá)。 結(jié)論 KATP通道開(kāi)放可以通過(guò)抑制ASMCs增殖而調(diào)控TGF-β1分泌表達(dá)；SOCS3和SOCS5可能是哮喘氣道重塑的特異性免疫治療中的重要靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] KATP通道開(kāi)放劑；氣道平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子；哮喘

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）10（b）-0004-04

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類負(fù)向調(diào)節(jié)因子[1]，參與多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其中SOCS3和SOCS5作為SOCS家族的重要成員，可能與哮喘等免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并有望成為這類疾病的治療靶點(diǎn)。有研究說(shuō)明[2]，ATP敏感性鉀通道（KATP通道）開(kāi)放劑對(duì)哮喘的氣道重塑可以產(chǎn)生有益的作用，其機(jī)制尚未見(jiàn)系統(tǒng)性的研究報(bào)道。本研究利用在體外原代培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP通道開(kāi)放劑的作用是否與逆轉(zhuǎn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，以及對(duì)SOCS3/5免疫失衡的影響，為治療哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自碧云天；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單抗，購(gòu)自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA試劑盒，購(gòu)自伊萊瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙據(jù)制藥股份有限公司；尼可地爾（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro醫(yī)藥公司；血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型膠原酶（collagenaseⅠ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，年齡21～36 d，體重100～140 g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。方法參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行改進(jìn)[3]。以10%的水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，放入超凈臺(tái)中，開(kāi)胸取出氣管，刮去外膜內(nèi)膜，D-Hank′s液洗凈，剪碎、消化后，用20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)1周左右，可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周圍爬出。實(shí)驗(yàn)用3～6代細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定平滑肌細(xì)胞上特有的α-SMA。

1.2.2 AngⅡ誘導(dǎo)ASMCs的增殖與表達(dá) AngⅡ（100 nmol/L）處理ASMCs，連續(xù)作用3 d，24 h換一次液；Western blotting檢測(cè)α-SMA，評(píng)定AngⅡ?qū)SMCs增殖誘導(dǎo)作用；上清中TGF-β1分泌表達(dá)用ELISA檢測(cè)（按說(shuō)明書(shū)操作），分為ASMCs組和AngⅡ·ASMCs組。

1.2.3 AngⅡ·ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng) 以AngⅡ處理ASMCs后，D-Hank′s液洗3遍，消化重懸，以1×106 cell/L鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h，加入提取的2 ml T淋巴細(xì)胞（1×105 cell/L），作用36 h，分為L(zhǎng)組、ASMCs+L組和AngⅡ·ASMCs+L組。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)SOCS3和SOCS5在共培養(yǎng)體系中的表達(dá) ①收集上清中的淋巴細(xì)胞，（5～10）×106單個(gè)核細(xì)胞加Trizol 1 ml，混勻后Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA含量。②RT-PCR反應(yīng)體系：RNA 4.0348 μg，Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ddH2O（RNAse free）至14.5 μl，70℃ 5 min，短暫離心后置于冰上；以上PCR管全部14.5 μl，5×RT緩沖液4 μl，HRP（RRI）/RNAse Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，ddH2O（RNAse free）至20 μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min。③Real-time PCR反應(yīng)體系：β-actin f（10 μmol/L）0.5 μl，β-actin r（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，Ex Taq 0.25 μl，10×Ex Taq E緩沖液2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O至25 μl，94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 4 min，4℃ 4 min，引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR反應(yīng)的引物序列及擴(kuò)增條件

1.2.5 KATP通道調(diào)節(jié)劑處理細(xì)胞 NCR（開(kāi)放劑）處理ASMCs以及共培養(yǎng)組細(xì)胞，并以DEX（治療藥）和GLI（拮抗劑）分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。加藥后細(xì)胞培養(yǎng)36 h，每12小時(shí)換一次液。Real-time PCR檢測(cè)SOCS3和SOCS5的表達(dá)差異；上清中TGF-β1分泌表達(dá)用ELISA檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ作用于ASMCs的增殖與表達(dá)

2.1.1 Western blotting檢測(cè)α-SMA的表達(dá) BandScan分析膠片灰度值分析后兩組α-SMA/β-actin的比較如圖1，可見(jiàn)，AngⅡ處理后的ASMCs表達(dá)α-SMA水平比未用AngⅡ處理的ASMCs組明顯升高，說(shuō)明AngⅡ處理ASMCs后可使細(xì)胞增殖。

圖1 AngⅡ處理前后ASMCs增殖的比較

α-SMA/β-actin代表ASMCs增殖量，與ASMCs組比較，*P<0.01

2.1.2 ELISA法檢測(cè)上清液中TGF-β1表達(dá)的差異 與ASMCs組比較，AngⅡ·ASMCs組TGF-β1的表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）（圖2）。

圖2 AngⅡ處理ASMCs前后TGF-β1表達(dá)的差異

與ASMCs組比較，*P<0.01

2.2 SOCS3和SOCS5 mRNA在共培養(yǎng)體系中的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果采用ΔΔCt法計(jì)算：目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），所以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，SOCS3 mRNA表達(dá)增加，而SOCS5 mRNA表達(dá)減少（P<0.05）；與ASMCs+L組比較，AngⅡ·ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，SOCS3 mRNA表達(dá)增加，而SOCS5 mRNA表達(dá)減少（P<0.05）（表2）。

表2 SOCS3和SOCS5基因表達(dá)相對(duì)量2-ΔΔCt值（x±s，n=3）

與L組比較，*P<0.05；與ASMCs+L組比較，#P<0.05

2.3 KATP通道開(kāi)放劑作用結(jié)果

2.3.1 藥物作用后上清中的TGF-β1表達(dá)差異 在各組用藥后DEX和NCR使ASMCs表達(dá)TGF-β1水平均比用拮抗劑GLI明顯減少（P<0.05）；而AngⅡ處理ASMCs后分泌表達(dá)TGF-β1比ASMCs組明顯增加（P<0.01）（表3）。

表3 檢測(cè)上清中的TGF-β1表達(dá)差異（x±s，n=3）

與拮抗劑GLI比較，*P<0.05；與ASMCs組比較，#P<0.01

2.3.2 藥物作用后SOCS3和SOCS5表達(dá)差異 與拮抗劑GLI比較，DEX和NCR作用與共培養(yǎng)體系可以下調(diào)SOCS3 mRNA的表達(dá)水平，上調(diào)SOCS5 mRNA的表達(dá)水平（表4）。

3 討論

支氣管哮喘以慢性氣道炎癥和氣道重塑為主要特征，伴隨發(fā)生氣道高反應(yīng)，而氣道重塑的機(jī)制和治療藥物是目前研究的熱點(diǎn)。支氣管平滑肌細(xì)胞是支氣管主要的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，其異常增殖在氣道重塑中起到十分重要的作用[4-5]。氣道平滑肌細(xì)胞增生的直接后果是造成氣道壁的增厚，加重氣道的狹窄，產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，造成呼吸道氣流受限，與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，有效遏制氣道平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖，是治療難治性哮喘的根本途徑之一[6]。收縮型ASMCs無(wú)增殖和遷移能力，對(duì)外界刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)，增殖/合成型能夠分泌表達(dá)多種活性物質(zhì)，具有增殖、遷移的能力[7]。本實(shí)驗(yàn)采用AngⅡ誘導(dǎo)，在體外建立增殖型ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示，ASMCs的增殖可以調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫相關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子的平衡，促進(jìn)SOCS3的表達(dá)而抑制SOCS5的表達(dá)，從而使SOCS3/5免疫失衡，表現(xiàn)為SOCS3與炎癥反應(yīng)正相關(guān)，而SOCS5則相反。TGF-β1的合成分泌與ASMCs增殖呈正相關(guān)，說(shuō)明TGF-β1可能參與哮喘ASMCs的增殖過(guò)程，在哮喘的發(fā)病過(guò)程中有重要的作用。TGF-β1與氣道損傷后的修復(fù)過(guò)程及氣道重塑有密切關(guān)系，其在氣道中表達(dá)增高能刺激氣道平滑肌細(xì)胞ASMCs分裂與增殖，導(dǎo)致平滑肌增生和肥厚及氣道重塑，從而加重哮喘。

鉀通道是體內(nèi)一種重要的離子通道，它廣泛分布于各種器官組織的細(xì)胞膜，在調(diào)節(jié)膜電位和興奮性方面起著重要作用；平滑肌上至少有三種鉀通道：鈣激活鉀通道（KCa）、遲整流鉀通道（Kdr）、KATP。其中，KATP最為重要，當(dāng)該通道開(kāi)放時(shí)，產(chǎn)生一系列電化學(xué)反應(yīng)，有效舒張平滑肌、起到降壓解痙的作用[8]，因此，KATP通道是多種疾病的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KATP通道開(kāi)放劑對(duì)ASMCs的增殖有抑制作用，相應(yīng)地TGF-β1也隨之減少，與拮抗劑有明顯的差異；同時(shí)，又可下調(diào)SOCS3 mRNA的表達(dá)，上調(diào)SOCS5 mRNA的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)ASMCs增殖所致的SOCS3/5表達(dá)失衡，說(shuō)明KATP通道開(kāi)放劑能夠抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖和分泌。

目前認(rèn)為[9-12]，SOCS通過(guò)兩條通路抑制信號(hào)傳導(dǎo)的作用，即JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT），有絲分裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 （MAPK/ERK），但是當(dāng)前對(duì)JAK/STAT通路研究較多，對(duì)MAPK/ERK通路研究較少。SOCSs通過(guò)細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT系統(tǒng)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖與分化等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，SOCS蛋白對(duì)Th細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用[9，13-14]，其中SOCS5/3與Th1/Th2免疫失衡密切相關(guān)，SOCS3主要表達(dá)在Th2細(xì)胞中并抑制Th1型免疫反應(yīng)，SOCS5通過(guò)抑制Th2細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)Th1細(xì)胞分化[15-17]。因此認(rèn)為KATP開(kāi)放劑能夠抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖分泌，并通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫因子和SOCS蛋白的免疫平衡產(chǎn)生治療作用，此方面的研究可望為臨床對(duì)哮喘的預(yù)防和治療提供新的思路。

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（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）