腓骨肌萎縮癥2型(CMT2)小鼠模型的研究進展

于珍,欒春杰,顧鳴敏

上海交通大學醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室,上海 200025

腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一類較常見的遺傳性周圍神經(jīng)疾病[1,2],全球的群體發(fā)病率約為1/2500[3]。該病主要呈常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant,AD),也可呈常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive,AR)及X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive,XR)[3]。CMT病人在患病初期往往表現(xiàn)為弓形足及杵狀指,由于下肢無力而呈現(xiàn)跨越步態(tài)。隨著疾病的進展,部分患者出現(xiàn)手部肌肉無力和萎縮,造成精細動作困難。末端神經(jīng)功能的喪失還會導致感覺功能減退,如辨別冷熱的能力下降。該病大多在青少年期起病,也有少數(shù)于中年起病[4～6]。目前,除了理療、定制矯形支架或外科手術外,臨床上還缺乏有效的治療手段,藥物治療僅對個別亞型有一定的作用[7]。根據(jù)神經(jīng)電生理和病理生理變化主要將CMT分為兩種類型：脫髓鞘型和軸索型。脫髓鞘型CMT約占總數(shù)的 2/3,其中以呈AD遺傳的CMT1最為多見,還包括呈AD遺傳的CMT3,呈XR遺傳的CMTX1和呈AR遺傳的CMT4。脫髓鞘型CMT的神經(jīng)電生理表現(xiàn)多為神經(jīng)傳導速度降低,神經(jīng)病理表現(xiàn)為“洋蔥頭”樣改變[8,9]。軸索型CMT約占總數(shù)的1/3,均為呈AD或AR遺傳的 CMT2。CMT2各亞型的神經(jīng)電生理表現(xiàn)為神經(jīng)傳導速度正常或輕度減慢,僅復合肌肉動作電位(cMAP)有所降低; 神經(jīng)病理檢查多無“洋蔥頭”樣改變[8,9]。目前已報道51個基因突變均可導致CMT,但其中的4個基因(PMP22、GJB1、MPZ、MFN2)突變所致的CMT占總數(shù)的90%以上[7]。在CMT1中,最常見的是由外周髓鞘蛋白22基因(PMP22)重復突變所致的 CMT1A,約占所有 CMT的 36%; 其次是由髓鞘蛋白零基因(MPZ)突變所致的 CMT1B,約占CMT的8.5%。在X連鎖遺傳的CMT中,由間隙連接蛋白32基因(Cx32)突變所致的CMTX1約占所有CMT的10%。在CMT2中,由線粒體融合蛋白2基因(MFN2)突變所致的 CMT2A2最常見,約占所有CMT中的5%和CMT2中的10%～30%[7,10]。然而,迄今對CMT的發(fā)病機制所知甚少,特別是導致CMT2的17個基因的致病機制尚缺乏較深入的研究。現(xiàn)有的研究通常認為CMT2的發(fā)生與軸索信號傳送障礙、線粒體膜融合異常、胞內(nèi)體的運輸受限、神經(jīng)原纖維素的產(chǎn)生不足和線粒體分子伴侶的功能異常相關[11]。同時也認為軸索變性是一種長度依賴性病變,神經(jīng)纖維越長,維持長距離軸漿運輸所需線粒體及其所產(chǎn)生的能量越多,因此 CMT2首先影響四肢遠端神經(jīng)纖維,并逐步導致其所支配的肌肉發(fā)生萎縮[11]。

建立 CMT2動物模型,不僅有助于從動物水平闡明突變基因的生物學功能及致病機制,而且對未來的分子診斷和靶向治療也具有重要的指導意義[12]。常用的模式生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)、小鼠(Mus musculus)等。但用于遺傳病致病機制研究的動物首選小鼠,理由是：①小鼠是地球上最小的哺乳動物之一,易于飼養(yǎng)且繁殖量大; ②小鼠在生物進化上與人類相近; ③人類 99%的基因存在于小鼠,基因同源性高達 78.5%,且小鼠基因組中約93%的基因排列順序與人類相同;④小鼠組織器官結構和細胞功能與人類相似[13]。本文主要綜述了 CMT2小鼠模型的構建策略、CMT2亞型及已建立的小鼠模型,舉例說明幾種 CMT2小鼠模型的表型特征及分子機制,最后分析了該領域尚存在的問題。

1 CMT2小鼠模型的構建策略與方法

常用的CMT2小鼠模型包括轉基因小鼠、突變基因敲除小鼠和突變基因敲入小鼠等。下面簡要介紹了這些小鼠模型的構建策略和方法。

1.1 運用轉基因技術構建CMT2小鼠模型

轉基因小鼠(Transgenic mice)是指通過細胞工程方法(如顯微注射技術)將外源目的基因注入小鼠受精卵的雄原核,再將該受精卵植入假孕小鼠體內(nèi)使其生長發(fā)育,最終篩選出基因組中整合了外源基因的新生小鼠[14]。完成鑒定的小鼠稱為首建鼠(Founder mice),將其進一步繁育成遺傳學上穩(wěn)定的小鼠品系,就可用于相關醫(yī)學研究。例如,2008年中南大學湘雅醫(yī)學院唐北沙課題組[15]通過位置候選克隆發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白 β8(HSPB8,也稱HSP22)為CMT2L的致病基因,并采用顯微注射技術建立了HSPB8K141N轉基因小鼠模型,并對小鼠模型進行了行為學、電生理學和病理學分析,以期再現(xiàn)CMT2L的臨床表型,用于 HSPB8 生物學功能分析和CMT2L發(fā)病機制研究。

1.2 運用基因敲除技術構建CMT2小鼠模型

基因敲除小鼠(Knock-out mice)是指利用同源重組原理,將完全失活或糾正的外源打靶基因取代內(nèi)源核基因組中的目標基因的轉基因小鼠[14]。目前常用的基因敲除方法有兩種：(1)組成型基因剔除：即在培養(yǎng)的胚胎干細胞(ES細胞)中直接將目的基因敲除或破壞,導致該基因失去功能; 該法易產(chǎn)生胚胎致死的后果,較難獲得理想的小鼠模型。(2)誘導型基因剔除：該法使目的基因的敲除發(fā)生在發(fā)育過程中人為設定的某一階段和特定的組織細胞中。由于該法在目的基因的兩側增加了 loxP位點,同時也又增加了Cre基因,可滿足定時和定點失活目的基因的要求,故能避免胚胎致死的產(chǎn)生,是目前首選的基因剔除技術[16]。例如,2001年Zhao等[17]報道了由該實驗室構建的驅(qū)動蛋白 1B(Kif1B)基因敲除小鼠模型,以期模擬 CMT2A1的表型。基因敲除小鼠Kif1B基因組來自一個 ES細胞系 J1的λEMBL3基因庫,包含P環(huán)和上游外顯子2.2 kb大小的區(qū)域被一個含較少poly(A)的neo篩選標記替換,獲得的嵌合體小鼠經(jīng)過回交,得到的雜合子小鼠與雜合子小鼠交配獲得突變純合子小鼠模型。

1.3 運用基因敲入技術構建CMT2小鼠模型

基因敲入小鼠(Knock-in mice)是指利用同源重組原理,將外源目的基因插入到核基因組目標基因序列的內(nèi)部或內(nèi)源目標基因啟動子之后的轉基因小鼠[14]。與基因剔除技術相比,該法的優(yōu)勢在于可在一個目標基因的編碼區(qū)若干堿基被去除的同時,另一個目標基因編碼區(qū)的若干堿基被替換。采用這種方法可以研究具有完全不同結構的兩個基因的產(chǎn)物是否具有相同的生物學功能[16]。已知髓鞘蛋白零基因(MPZ)編碼一種外周髓鞘的主要結構蛋白,該基因突變會導致CMT2I/CMT2J/CMT1B等疾病。2012年Saporta等[18]報道了由該實驗室構建的MpzR98C基因突變敲入小鼠模型。編碼MPZR98C的突變通過同源重組被定位到Mpz等位基因上。接著,通過定點誘變和序列分析證實該突變已被引入Mpz基因第3號外顯子中?？寺∑芜B接成含有新霉素抗性基因構造的loxP位點。構建的R98C neoLP和WT neoLP載體通過顯微注射進入 TBV2胚胎干細胞。然后將陽性胚胎干細胞克隆入野生型小鼠的囊胚中獲得嵌合體。通過種系繁殖及鑒定,獲得遺傳背景為 FVB/N或C57BL/6N的MpzR98C敲入小鼠模型。

2 CMT2亞型及其小鼠模型概覽

迄今已報道的CMT2致病基因共有17個,由此產(chǎn)生相應的 CMT2亞型,包括本實驗室近期報道的由脫氫酶 E1和轉酮酶結構域 1(Dehydrogenase E1 and transketolase domain containing 1,DHTKD1)無義突變所致的CMT2Q[19]。在已經(jīng)報道的CMT2亞型中,有些亞型已建立了小鼠模型,并開展了小鼠的表型分析及機制研究[20]; 有些亞型正在構建小鼠模型,為后續(xù)研究作準備。CMT2各亞型的遺傳方式、OMIM 編號、疾病基因名稱及定位、小鼠模型的構建方法及主要特征等見表1。

3 部分 CMT2亞型小鼠模型的表型特點及病理機制

3.1 CMT2A1小鼠模型

已知驅(qū)動蛋白 1B(KIF1B)突變會導致人類CMT2A1。該基因編碼兩個異構體：KIF1Bα與KIF1Bβ。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn) KIF1Bβ與 KIF1Bα的底物結合域明顯不同。為了驗證KIF1B基因在體內(nèi)的重要功能,該實驗室成功建立了Kif1B基因敲除小鼠模型,其中突變純合子小鼠(Kif1B-/-)的出生率符合孟德爾遺傳定律,但是在出生30 min內(nèi)死亡。研究發(fā)現(xiàn)純合子小鼠出現(xiàn)肺泡不能擴張,由此導致小鼠窒息和死亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)新生的純合子小鼠表現(xiàn)出多種神經(jīng)異常,如對刺激反應不敏感,運動神經(jīng)功能喪失。與野生型小鼠(Kif1B+/+)相比,純合子小鼠大腦體積減少約 10%、腦干核心以及聯(lián)合纖維的形態(tài)及發(fā)育受損、神經(jīng)元數(shù)量減少(約 25%)、海馬體的細胞結構及組織形態(tài)受損,突觸小泡的密度明顯降低。此外,背側及腹側骨髓網(wǎng)狀核(MdD和MdV)神經(jīng)元數(shù)量減少。雜合子小鼠(Kif1B+/-)在出生一年后才逐步表現(xiàn)出跨越步態(tài),最終不能支撐自身體重,只能通過偶爾的跳躍來移動身體,表現(xiàn)出類似CMT2A1患者的特點。在滾軸、固定桿和握力實驗中,雜合子比野生型小鼠明顯減弱; 而在測定感覺的熱板實驗中,雜合子與野生型小鼠并沒有出現(xiàn)顯著性差異。為了進一步探究肌無力的本質(zhì),直接刺激12月齡雜合子小鼠的足底肌,以測量坐骨神經(jīng)誘發(fā)的復合動作電位,結果發(fā)現(xiàn)雜合子小鼠的振幅有明顯變化,但神經(jīng)傳導速度沒有明顯改變。另外,遠端肌肉的組織病理學分析也未見明顯差異。在雜合子小鼠中還觀察到腦干中心及結合處的軸索發(fā)育受損并且脊柱中軸索發(fā)育受損,這一現(xiàn)象被認為是周圍神經(jīng)病變嚴重的特征。此外,Kif1B-/-神經(jīng)元的低存活率可以通過 KIF1Bβ 的 cDNA 的表達來補救,而不是通過 KIF1Bα,表明在神經(jīng)元中 KIF1Bβ表現(xiàn)出了自主行為,這與CMT2A1作為軸索病變而非髓鞘病變的臨床意義保持一致。課題組又分析了CMT2A1患者中KIF1B的序列,發(fā)現(xiàn)其ATP結合結構域存在Q98L的錯義突變。綜上所述,KIF1Bβ蛋白的改變降低了ATPase的活性和功能,并且由該基因產(chǎn)生的馬達蛋白含量減半,不能維持軸索所需的動力,導致神經(jīng)末梢功能障礙,最后出現(xiàn) CMT2A1的表型。

表1 CMT2亞型及其小鼠模型一覽表

3.2 CMT2A2小鼠模型

1997年,Saito等[35]報道了一個日本家系患有CMT2A2。2004年,Zuchner等[36]確認了線粒體融合蛋白2基因(MFN2)為CMT2A2的致病基因。MFN2是線粒體融合中必須的GTPase基因。2008年,Detmer等[21]構建了在周圍運動神經(jīng)元表達人源Mfn2T105M基因的轉基因小鼠,該小鼠通過劑量依賴效應表現(xiàn)出典型的CMT2A2的臨床特征,其中雜合子小鼠出生時僅表現(xiàn)出輕微的短尾,而純合子小鼠出生時則出現(xiàn)明顯的短尾及畸形,還出現(xiàn)后肢緊縮,不能正常伸展,以及嚴重的步態(tài)異常。為了進一步了解純合子小鼠后肢缺陷的原因,秤取了該小鼠腓腸肌的重量,發(fā)現(xiàn)突變純合子小鼠腓腸肌的重量明顯減輕,肌肉病理檢查也證實腓腸肌明顯萎縮。但小鼠轉軸實驗和步態(tài)分析未見明顯異常。由于Mfn2T105M突變能引起線粒體分布缺陷,為此Detmer等檢測了轉基因小鼠運動神經(jīng)元中線粒體的形態(tài)學和分布,定量實驗證實純合子小鼠運動神經(jīng)元中線粒體分布不均勻,出現(xiàn)線粒體異常聚集,推測這是導致軸索病變的原因。值得指出的是,小鼠運動神經(jīng)元中線粒體分布紊亂及產(chǎn)生的神經(jīng)病變只發(fā)生在過表達的轉基因小鼠中,而未出現(xiàn)在基因敲入小鼠中,原因尚在分析中。

3.3 CMT2B1小鼠模型

1999年,Bouhouche等[37]報道了核纖層蛋白A/C(LMNA)基因突變(c.Arg298Cys)可導致CMT2B1。同年 Sullivan等[38]報道了純合型Lmna敲除小鼠表現(xiàn)出異常步態(tài)、后肢疲軟、前肢無法支撐整個身體因此行走姿勢僵硬,且在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)進行性加重的脊柱側彎,但在同窩雜合子小鼠中未觀察到上述表型。為了進一步了解LMNA純合突變對外周軸索損傷的作用,Sullivan等[38]對Lmna基因敲除小鼠的坐骨神經(jīng)進行了超微結構的分析,結果發(fā)現(xiàn)突變純合子小鼠坐骨神經(jīng)軸索密度大幅度降低,甚至出現(xiàn)無髓鞘軸索,這些表型都與2002年De Sandre-Giovannoli等[23]報道的 AR-CMT2患者的表型特征極為相似。以往的研究還表明LMNA基因突變與肢帶型肌營養(yǎng)不良 1B型(LGMD1B)、AD遺傳的Emery-Dreifuss肌營養(yǎng)不良(AD-EDMD)和擴張性心肌病伴心臟傳導阻滯 1A(CMD1A)等疾病有關,表明核纖層蛋白A/C的不同功能域?qū)τ诰S持和整合不同細胞系的功能至關重要。因此不同疾病的相似特征在臨床診斷分型中需格外注意。

3.4 CMT2D小鼠模型

已知編碼甘氨酰-tRNA合成酶基因(GARS)的突變可導致人類CMT2D。2006年,Seburn等[25]通過定位克隆構建了突變誘導的 Nmf249顯性小鼠模型。在該小鼠中,Gars基因有一段 AAATA取代了 CC,導致由該基因第 278位編碼的脯氨酸(Pro)突變?yōu)槔野彼?Tyr)和賴氨酸(Lys),結果突變純合子小鼠(GarsNmf249/Nmf249)出現(xiàn)胚胎致死現(xiàn)象,而雜合子小鼠(GarsNmf249/+)則出現(xiàn)運動感覺神經(jīng)疾病的癥狀,還在3周齡時出現(xiàn)神經(jīng)肌肉功能障礙,尤以遠端肌肉為甚,體型較小,壽命縮短。病理檢查發(fā)現(xiàn)軸索直徑減小,大直徑軸索數(shù)量減少,神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)的突觸連接處及肌肉出現(xiàn)去神經(jīng)化病理改變,但未發(fā)現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象。神經(jīng)電生理檢查顯示突變小鼠的神經(jīng)傳導速度顯著降低(約下降 60%)。分子生物學分析顯示該突變并未影響Gars基因的mRNA表達,并且對甘氨酰-tRNA合成酶的酶動力學以及酶的活性都沒有產(chǎn)生影響。Seburn等[25]認為這些現(xiàn)象不能用單倍體缺失效應或者顯性負性效應來解釋,因此提出了另一種假設,即GarsNmf249基因突變引起的外周神經(jīng)病變與甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)蛋白的功能異常有關,而與GlyRS活性喪失無關。

3.5 CMT2E小鼠模型

人體中神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NF-L,又稱 NEFL)的突變與 CMT2E相關,受累者的嚴重程度隨不同突變而有所不同,且同一突變在不同家庭中也會有所不同,呈現(xiàn)出異質(zhì)性的特征。為了研究該病的致病機制,Shen等[28]構建了一種新的CMT2E小鼠模型,該小鼠持續(xù)表達帶有人類hNF-LE397K基因突變的產(chǎn)物。表型分析發(fā)現(xiàn),不同年齡階段小鼠體內(nèi) hNF-L受限程度不同,并表現(xiàn)出進行性加重的現(xiàn)象。其中1月齡hNF-LE397K小鼠以運動神經(jīng)元胞體(NFs)磷酸化的異位積累為特征,表現(xiàn)出相對較輕的神經(jīng)病變。4月齡小鼠出現(xiàn)明顯的表型,包括異常的后肢姿勢,足趾畸形,自發(fā)性活動減少,感覺神經(jīng)的軸索數(shù)量減少,運動神經(jīng)傳導速度(MNCVs)降低。有趣的是,隨著年齡增大,突變小鼠并未出現(xiàn) NFs在運動神經(jīng)元中的大量累積,NF網(wǎng)狀結構似乎也沒有受到大范圍的影響。下肢遠端肌肉萎縮,但仍然受坐骨神經(jīng)的支配,也未去神經(jīng)化。Shen等[28]推測產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與突變小鼠肌肉的感覺神經(jīng)支配發(fā)生的改變有關,即因大量感覺神經(jīng)的軸索缺失造成后肢姿勢異常。除了hNF-LE397K小鼠模型外,目前還建成了hNF-LP22S小鼠模型[30],兩者相比在表型方面較為相似,但在病理機制方面則存在差異,說明不同功能域改變可導致不同的病理變化。

3.6 CMT2F小鼠模型

2001年,Ismailov等[39]首次報道熱休克蛋白 β1(HSPB1)基因突變(S135F)可導致人類CMT2F。2011年,d’Ydewalle等[32]建立了人源Hspb1S135F轉基因小鼠,表型分析顯示該小鼠具有軸索性CMT受累者的臨床和病理特征。所有轉基因小鼠出生時均正常,符合孟德爾遺傳規(guī)律,存活率與野生型小鼠相比沒有顯著差異。6個月后進行懸尾實驗發(fā)現(xiàn),Hspb1S135F突變小鼠的后肢出現(xiàn)萎縮病變; 行為學實驗(轉軸和熱板實驗)顯示突變小鼠出現(xiàn)進行性運動損傷,肌張力降低。6～8月齡小鼠的復合肌肉動作電位(cMAPs)的波幅明顯降低,且感覺神經(jīng)動作電位(SNAPs)中基線到波峰的振幅明顯降低。該課題組認為Hspb1S135F小鼠表型可用功能獲得性機制解釋。研究還發(fā)現(xiàn)由Hspb1S135F小鼠中分離的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元細胞中線粒體運輸受到嚴重影響。進一步分析顯示沿著軸索的胞內(nèi)運輸需動力蛋白在指定的分子(如乙酰化的 α-微管蛋白)作用下運送“貨物”。對于線粒體運輸而言,移動的線粒體會優(yōu)先定位于乙?；奈⒐芴帯Ｈ绻?α-微管蛋白乙?；^程受阻就容易導致神經(jīng)退行性疾病的產(chǎn)生。d’Ydewalle 等發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠外周神經(jīng)中乙?；?α-微管蛋白總量大幅降低。但是,抑制微管蛋白去乙?；?HDAC6)可以重新調(diào)節(jié)乙酰化的 α-微管蛋白水平,緩解軸索運輸障礙,表明Hspb1突變導致的 CMT2F 可能存在去乙?；瘷C制。使用α-微管蛋白乙?；种苿┲委烪spb1突變小鼠,能在行為學與電生理水平部分修復CMT2F的表型,表明α-微管蛋白乙?；降慕档驮谟蒆SPB1突變導致的CMT2F的致病機制中發(fā)揮重要作用。

3.7 CMT2Q小鼠模型

我們對來自山東高密的一個CMT2大家系進行了研究。全基因組掃描和連鎖分析顯示疾病表型與10p12-14緊密連鎖,該區(qū)域覆蓋 D10S585與D10S1477之間的微衛(wèi)星標記,共5.41 Mb。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)所有受累者的脫氫酶 E1和轉酮酶結構域 1基因(DHTKD1)第 8外顯子存在一個無義突變[c.1455T>G(p.Tyr485*)][19]。進一步研究顯示受累者外周血中DHTKD1的mRNA表達水平只有未受累者的一半。細胞水平研究顯示在轉染了帶無義突變的mRNA和截短蛋白的細胞中轉錄產(chǎn)物的降解速度明顯快于野生型細胞。沉默無義介導的 mRNA降解(NMD)途徑中的促進因子UPF1能有效地阻止因無義突變所造成的mRNA和蛋白質(zhì)水平的下降[40]。更為重要的是,沉默DHTKD1可導致細胞能量產(chǎn)生的受限,表現(xiàn)為 ATP、總 NAD+和 NADH,以及NADH水平的下降。綜上所述DHTKD1的無義突變是導致CMT2Q的分子基礎,提示DHTKD1在線粒體能量產(chǎn)生及神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用[19]。目前國內(nèi)外學者有關DHTKD1基因功能的研究僅限于體外研究,活體內(nèi)的研究尚未展開,所以對于DHTKD1的功能缺失作用能否在小鼠體內(nèi)再現(xiàn)尚不明確。為了更好地研究DHTKD1基因的生物學功能及該基因突變導致CMT2Q的分子機制,我們利用Red/ET同源重組技術構建了Dhtkd1點突變基因敲入打靶載體,通過同源重組技術成功地在Dhtkd1基因第8號外顯子和第9號外顯子之間插入1個Lox P位點、2個Frt及1個neo篩選標記,通過囊胚腔注射獲得嵌合體小鼠,并通過與野生型小鼠交配得到含有突變位點的雜合子小鼠。接著,雜合子小鼠互相交配得到突變純合子、雜合子與野生型小鼠,為下一步從動物水平研究Dhtkd1基因的生物學功能奠定了基礎[34]。目前進行的表型分析顯示 3種基因型小鼠的繁殖情況正常,野生型、雜合子和純合子小鼠的比例符合孟德爾遺傳定律(1∶2∶1),并未出現(xiàn)純合子胚胎致死或早亡。3種基因型小鼠坐骨神經(jīng)的病理學分析(包括半薄切片光鏡和電鏡觀察)顯示突變純合子小鼠軸索中大徑纖維的比例明顯少于野生型小鼠,且髓鞘出現(xiàn)內(nèi)陷、外凸或畸形的比例也高于野生型小鼠。實時熒光定量PCR實驗結果顯示野生型小鼠坐骨神經(jīng)和肝臟中DHTKD1的轉錄產(chǎn)物(mRNA)水平最高,突變純合子最低,雜合子介于二者之間。突變純合子小鼠腎臟中DHTKD1未檢出、雜合子僅為野生型的一半含量; 能量代謝實驗結果顯示突變純合子小鼠的ATP含量明顯低于野生型,且NADP+/NADPH的比值也存在顯著性差異。行為學實驗顯示突變純合子小鼠較野生小鼠的感覺遲鈍(足爪熱痛實驗); 野生型小鼠在滾軸上持續(xù)的時間高于雜合子和純合子(滾軸試驗)。考慮到在人體中CMT2Q屬晚發(fā)型、漸進性疾病,并且已有的一些 CMT2型小鼠模型的發(fā)病年齡大多在 10月齡以后,所以Dhtkd1Tyr486*敲入小鼠模型可能尚未到出現(xiàn)明顯表型的年齡,我們期望隨著突變敲入小鼠年齡的增長能觀察到更明顯的表型。

4 問題與展望

CMT2是一種高度遺傳異質(zhì)性的疾病,目前已克隆了17個致病基因,但仍有一些CMT2的致病基因未知。隨著外顯子捕獲及二代測序技術的日益普及,相信會有更多導致 CMT2的致病基因被定位和克隆[41],并為突變基因致病機制的研究及臨床診治奠定基礎。為了從動物水平明確CMT2的發(fā)病機制,就必須借助動物模型開展相關研究。目前已成功建立了近 10種 CMT2的動物模型,并能部分模擬CMT2各亞型的臨床表型。然而,在小鼠模型構建中也經(jīng)常會出現(xiàn)小鼠模型與人類疾病表型不一致甚至不出現(xiàn)任何表型的情況,這對研究人員而言是個棘手的問題。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是多方面的：其一,小鼠和人類基因組雖然同源性極高,但同源性畢竟未達到100%,尤其在信號傳導、生理生化方面仍存在很多差異; 其二,機體發(fā)育過程中其他基因的補救或代償作用可以減弱甚至消除某一突變基因的致病效應; 其三,在基因工程小鼠構建過程中,引入單個點突變的同時也會引入 neo等篩選標記。雖然多數(shù)情況下篩選標記的引入對基因功能不會產(chǎn)生顯著影響,但有時也會對被修飾基因產(chǎn)生一些負面作用,從而很難實現(xiàn)完全自然狀態(tài)的模擬[28]。為此,在CMT2小鼠模型建立時必須充分考慮上述因素的影響,并采取相應的應對策略。

已知 CMT2是一種神經(jīng)源性肌肉疾病,涉及到軸索的長距離運輸。由于人類與小鼠在體型及解剖結構方面存在一定的差異,特別是人類軸索延伸至下肢的距離相比小鼠的距離要長,因此突變對小鼠下肢肌肉的影響可能會較小,病變程度也可能較輕。近年來對運動神經(jīng)元疾病的研究還發(fā)現(xiàn)微環(huán)境在CMT2發(fā)病過程及疾病進展過程中起著至關重要的作用。攜帶突變基因的運動神經(jīng)元通常可在衰老及炎癥環(huán)境的誘導下發(fā)生病變,而病變后的運動神經(jīng)元又反過來使得微環(huán)境及膠質(zhì)細胞更加惡化,這樣疾病逐漸發(fā)展[42]。為進一步研究CMT2的發(fā)病機制,還需要構建更多在時間和空間方面能得到控制的CMT2小鼠模型。

科學工作者開展CMT2研究的目的都是為了人類健康,然而到目前為止,還沒有一項研究專門側重于尚未出現(xiàn)CMT2癥狀的年輕人的心理健康。國際遺傳顧問協(xié)會(NSGC)和美國人類遺傳協(xié)會(ASHG)發(fā)起在兒童中檢測成年期發(fā)病的活動,目的就是為兒童提供更好的照顧。該項活動側重于病人自發(fā)的、符合法律規(guī)定的檢測,所有先證者和家人都應考慮到醫(yī)療、社會、心理和生殖問題。對于CMT而言,無癥狀或癥狀不明顯的兒童不會從確診為CMT疾病中獲得任何好處,變幻莫測的疾病發(fā)展趨勢以及缺乏預防保健意識無疑對兒童的未來生涯和人生規(guī)劃產(chǎn)生巨大挑戰(zhàn)。因此早期診斷可以提前阻止疾病的發(fā)生并且提供長期的護理保障,這對于兒童未來的生活將會產(chǎn)生巨大益處[7]。

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