復(fù)雜疾病的遺傳易感基因區(qū)域的精細(xì)定位

宋慶峰,張紅星,馬亦龍,周鋼橋

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院介入治療科,南寧 530021;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心,蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;3.蛋白質(zhì)藥物國(guó)家工程研究中心,北京 102206;4.國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京),北京 102206

截止到2012年4月,以單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism,SNP)為遺傳標(biāo)記,采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome wide association studies,GWAS)的策略已在 666種疾病(或性狀)中發(fā)現(xiàn)了3869個(gè)顯著關(guān)聯(lián)(P<5.0×10–8)的遺傳易感基因區(qū)域[1]。但是,在這些區(qū)域內(nèi),與復(fù)雜疾病最顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異或致病性遺傳變異都有待進(jìn)一步確認(rèn),其生物學(xué)功能也尚待深入闡明。當(dāng)遺傳易感基因區(qū)域內(nèi)的 SNP位點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)以及存在遺傳因素和環(huán)境因素交互作用時(shí),上述工作變得更加具有挑戰(zhàn)性。后GWAS時(shí)代的主要任務(wù)之一是對(duì)復(fù)雜疾病易感區(qū)域內(nèi)的致病性遺傳變異進(jìn)行精細(xì)定位(Fine mapping),即在通過(guò)GWAS鑒定到的疾病易感區(qū)域內(nèi)獲取高密度的遺傳變異目錄及其基因型,從中鑒定出易感區(qū)域內(nèi)最顯著關(guān)聯(lián)或致病性的遺傳變異,并闡明其生物學(xué)功能[2]。目前,已出現(xiàn)一些系統(tǒng)性的策略用于復(fù)雜疾病的精細(xì)定位研究(表1)。

1 針對(duì)常見(jiàn)遺傳變異(Common variant)的精細(xì)定位研究

1.1 確定最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)

SNP是可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種變異形式,在群體中其次要等位頻率(Minor allele frequency,MAF)大于1%。目前,GWAS采用的商業(yè)化SNP分型芯片已經(jīng)可以同時(shí)檢測(cè)100萬(wàn)個(gè)甚至更多的SNP位點(diǎn)。但是,這些芯片仍遠(yuǎn)未能覆蓋人類基因組中的全部 SNP位點(diǎn),一些與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)可能會(huì)被遺漏。因此,獲得易感基因區(qū)域內(nèi)高密度的SNP目錄是進(jìn)行精細(xì)定位的前提之一。可以通過(guò)以下兩種方法增加易感基因區(qū)域內(nèi)的 SNP密度,然后再進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)分析,以確定最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。

1.1.1 根據(jù)參考數(shù)據(jù)集進(jìn)行SNP的推斷(Imputation)

由許多國(guó)家共同參與的“人類基因組單體型圖計(jì)劃”(HapMap計(jì)劃)和“千人基因組計(jì)劃”(1000 genome project)為人們提供了比較全面的人類基因組DNA序列變異數(shù)據(jù)。以這些研究計(jì)劃產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)為參考集,可以通過(guò)計(jì)算推斷出與已分型 SNP位點(diǎn)相鄰的未分型SNP位點(diǎn)的基因型,從而大大降低遺漏的可能性[3]。用于推斷的代表性軟件有MACH[4]和IMPUTE[4]等,現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。例如,Raychaudhuri等[5]以2767個(gè)個(gè)體的全基因組數(shù)據(jù)為參考集,對(duì)6個(gè)獨(dú)立的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的GWAS數(shù)據(jù)集進(jìn)行推斷,并對(duì)推斷結(jié)果進(jìn)行了遺傳關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果在 MHC區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)新的與疾病顯著關(guān)聯(lián)的 SNP 位點(diǎn)(P<1.0 ×10–550)。Peters等[6]在 20488 個(gè)非洲裔美國(guó)人中,對(duì)體重指數(shù)(Body mass index,BMI)的候選易感基因區(qū)域——FTO基因所在的基因組區(qū)域(646 kb)進(jìn)行推斷和關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果鑒定出一個(gè)新的與體重指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)rs56137030(P= 8.3 × 10-6)。Liu 等[7]在來(lái)自英國(guó)的 2861 例原發(fā)性膽汁性肝硬化患者(Primary biliary cirrhosis,PBC)和 8514例對(duì)照中,對(duì)約 20萬(wàn)個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型、推斷和關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與PBC顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(P<5.0 ×10–8)。以往在日本人群中開(kāi)展的 GWAS研究發(fā)現(xiàn),MICA基因上的rs2596542與丙型肝炎(Hepatitis C virus,HCV)相關(guān)的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)顯著關(guān)聯(lián)。Lange等[8]進(jìn)一步在瑞士人群中對(duì)此區(qū)域進(jìn)行了分型和推斷,關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,MICA基因上游HCP5基因上的rs2244546是一個(gè)新的疾病易感性標(biāo)志物。

SNP的推斷基于單體型結(jié)構(gòu)和單體型內(nèi)各SNP位點(diǎn)之間的LD程度,參考集的樣本量越大,推測(cè)的成功率和準(zhǔn)確率就越高。但是在現(xiàn)階段,各項(xiàng)研究所能提供的參考集的樣本量均較小。另外,有些SNP位點(diǎn)在人群中等位頻率較低(MAF <2%),且與鄰近的已被芯片檢測(cè)到的 SNP位點(diǎn)并不存在較強(qiáng)的LD(r2<0.8),從而無(wú)法被成功推斷出來(lái)[9]。因此,用推斷這種方法無(wú)法徹底解決最顯著關(guān)聯(lián)的SNP被遺漏的情況。

1.1.2 對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序(Target region resequencing)

對(duì)GWAS鑒定的易感基因區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序,將有助于全面了解一個(gè)區(qū)域內(nèi)所有的遺傳變異信息,并發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的 SNP位點(diǎn)。此外,還可以發(fā)現(xiàn)一些新的功能性罕見(jiàn)變異(Rare variation)[10]或結(jié)構(gòu)變異,如拷貝數(shù)變異(Copy number variation,CNV)[11]和小的插入-缺失變異(Indel)等[12],從而鑒定到易感基因區(qū)域內(nèi)與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的或致病性的其他各類遺傳變異形式。近年來(lái),高通量的二代測(cè)序技術(shù)得以迅速發(fā)展,大大降低了測(cè)序的費(fèi)用及縮短了測(cè)序的時(shí)間,使得在大量樣本中進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的重測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)。例如,Xiang等[13]對(duì)已知的高原低氧適應(yīng)基因EGLN1所在的基因組區(qū)域(長(zhǎng)約 59.4 kb)進(jìn)行重測(cè)序,新發(fā)現(xiàn)一個(gè)非同義突變(rs186996510,D4E)的頻率在高原藏族人群和低海拔漢族人群中存在顯著差異(Fst= 0.709),提示rs186996510可能是高原低氧適應(yīng)的成因性SNP。在對(duì)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的易感基因重測(cè)序研究中,除了發(fā)現(xiàn)新的顯著關(guān)聯(lián)的常見(jiàn)變異位點(diǎn)外,還在MYB基因上發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)新的與疾病顯著關(guān)聯(lián)(P=5.0×10–3)的罕見(jiàn)遺傳變異[14]。

1.2 通過(guò)SNP位點(diǎn)篩選候選易感基因

確定了與復(fù)雜疾病等性狀最顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異后,還要闡明其生物學(xué)功能。通過(guò)GWAS鑒定到的最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)大多位于內(nèi)含子、基因間區(qū)等非編碼區(qū)域內(nèi),這對(duì)于直接闡明易感SNP位點(diǎn)的生物學(xué)功能造成了一定的困難。研究顯示,這些SNP位點(diǎn)主要通過(guò)改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平或者轉(zhuǎn)錄本的剪接等方式影響疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[15]。

1.2.1 通過(guò)調(diào)控元件分析尋找功能性的SNP位點(diǎn)和易感基因

啟動(dòng)子、沉默子和絕緣子等基因表達(dá)調(diào)控元件,能夠通過(guò)正調(diào)控[16]或負(fù)調(diào)控[17]的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)量。而組蛋白、非編碼RNA等表觀調(diào)控元件,能夠通過(guò)末端修飾[18]、自身活性的改變[19]或量的改變[20]等機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)量。因此,位于各類調(diào)控元件序列中的與疾病易感性顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異,有可能通過(guò)自身等位型的變化影響這些調(diào)控元件的調(diào)控機(jī)制而影響相關(guān)基因的表達(dá)水平,從而影響疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[21]。例如,Pomerantz等[22]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌的易感基因區(qū)域8q24中最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)是rs6983267,該SNP位于MYC基因的增強(qiáng)子序列內(nèi),其風(fēng)險(xiǎn)等位型能夠增加MYC基因的增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2的結(jié)合,導(dǎo)致MYC基因的表達(dá)量增加,從而增加結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Peters等[6]在FTO基因所在基因組區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與體重指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)rs56137030(P= 8.3 × 10-6),并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有多個(gè)與之呈強(qiáng)LD的 SNP位點(diǎn)處于調(diào)控元件之中,其中 rs1421085在轉(zhuǎn)錄因子CUX1的結(jié)合上具有等位特異性。也有研究發(fā)現(xiàn),某些遺傳變異可以影響基因網(wǎng)絡(luò)內(nèi)不同中樞節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)絡(luò),進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)量,最終影響疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[23]。

表1 精細(xì)定位的研究策略

1.2.2 通過(guò)eQTL分析尋找功能性的SNP位點(diǎn)和易感基因

在人類基因組上,能夠影響基因的mRNA或蛋白表達(dá)水平的遺傳變異位點(diǎn)稱為表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)(Expression quantitative trait locus,eQTL),檢測(cè)遺傳變異與mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)量之間是否有關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)分析,稱為eQTL分析[24]。對(duì)GWAS鑒定到的易感基因區(qū)域內(nèi)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行eQTL分析,有可能發(fā)現(xiàn)直接影響相關(guān)基因表達(dá)、進(jìn)而改變疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的功能性SNP位點(diǎn)。按照功能性SNP位點(diǎn)與受其調(diào)控的基因之間的距離,可以分為順式(cis-eQTL,1 Mb范圍內(nèi))和反式(trans-eQTL,1 Mb范圍之外)調(diào)控兩種類型[25]。在以往的研究中,eQTL分析大多是在淋巴細(xì)胞系中進(jìn)行,例如 Morley等[26]在 14個(gè)大家系的永生化B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),近1000個(gè)SNPs能夠作為順式或者反式eQTL位點(diǎn)調(diào)節(jié)3554個(gè)基因的表達(dá)量。但是,在復(fù)雜疾病的研究中,eQTL分析更應(yīng)該在與疾病對(duì)應(yīng)的特定組織中進(jìn)行[27]。例如,在肝臟組織中,對(duì)高脂血癥的易感基因區(qū)域 1p13開(kāi)展的eQTL分析顯示,最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(rs12740374,P< 1.0 × 10–40)的風(fēng)險(xiǎn)等位型能增強(qiáng)SORT1基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子 C/EBP的結(jié)合,從而增加該基因在肝臟中的表達(dá),使肝臟中極低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein,VLDL)的分泌增加,進(jìn)而增加血清中低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL)和 VLDL的濃度,最終增加高脂血癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[28]。

1.3 通過(guò)確定顯著關(guān)聯(lián)的單體型和跨種族的單體型對(duì)比來(lái)確定候選易感基因

單體型是指在后代個(gè)體中沒(méi)有發(fā)生重組的祖先染色體片段。由于構(gòu)成單體型的SNP位點(diǎn)都位于同一條染色體上的某一區(qū)域內(nèi),且各位點(diǎn)之間具有一定程度的LD,所以有時(shí)難以通過(guò)獨(dú)立性檢驗(yàn)判定哪個(gè) SNP位點(diǎn)與疾病更具有關(guān)聯(lián)性。在這種情況下,這些SNP位點(diǎn)可能以單體型的形式與疾病相關(guān)聯(lián)[2]。例如,Galameau等[14]在對(duì)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的研究中,發(fā)現(xiàn)rs7599488和rs10189857(r2= 0.96)與血紅蛋白濃度之間存在顯著關(guān)聯(lián); 進(jìn)一步的單體型分析發(fā)現(xiàn),與既往研究中所發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs4671393(P=3.7 × 10–37)相比,rs7599488、rs10189857 和 rs4671393構(gòu)成的單體型具有更加顯著的關(guān)聯(lián)程度((P= 4.0×10–45),從而提示這3個(gè)SNP位點(diǎn)通過(guò)單體型的形式共同在鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的易感性上發(fā)揮作用。

在確定了單體型與疾病的相關(guān)性后,如何確定候選易感基因是極其關(guān)鍵的一步。對(duì)于一些長(zhǎng)度較短、只包含有一個(gè)基因的單體型而言,可直接將該基因確定為候選易感基因。對(duì)于長(zhǎng)度較長(zhǎng)、包含有多個(gè)基因的單體型而言,可以嘗試在不同種族人群之間比較SNP位點(diǎn)之間LD程度的差異來(lái)定位候選易感基因。

HapMap計(jì)劃和千人基因組計(jì)劃的單體型數(shù)據(jù)顯示,同一基因組區(qū)域內(nèi)的單體型結(jié)構(gòu)在不同種族之間具有差異性。非洲人的單體型比其他種族的單體型更短,原因在于非洲人有更長(zhǎng)的歷史,從而有更多的重組來(lái)打破原有單體型的結(jié)構(gòu),從而形成新的單體型。同時(shí),大量 GWAS顯示,同種疾病在不同種族之間具有共同的易感區(qū)域[29]。例如,針對(duì)發(fā)作性睡病(Narcolepsy)的GWAS顯示,19q13.2區(qū)域是高加索人、亞洲人和非洲裔美國(guó)人 3個(gè)不同種族共同的易感基因區(qū)域[30]。6q23區(qū)域是高加索人和亞洲人共有的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感基因區(qū)域,進(jìn)一步對(duì)比兩個(gè)種族中該區(qū)域的風(fēng)險(xiǎn)單體型結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其中有連續(xù)6個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型完全一致。因此,推測(cè)這6個(gè)位點(diǎn)所構(gòu)成的單體型可能為兩種人群共有的風(fēng)險(xiǎn)單體型,據(jù)此可將易感基因區(qū)域縮小至 48.5 kb,并確定了TNFAIP3是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的候選易感基因[31]。最近,Wu等[32]通過(guò)在不同種族人群中對(duì)血脂水平的候選易感基因進(jìn)行精細(xì)定位分析,成功地將GCKR、PPP1R3B、ABO、LCAT和ABCA1等易感基因的致病性位點(diǎn)進(jìn)一步縮小了范圍,例如發(fā)現(xiàn)GCKR基因中的功能性變異 rs1260326(P446L)可能是甘油三脂水平的成因性 SNP。因此,在不同種族中比較同一易感基因區(qū)域的單體型結(jié)構(gòu),有利于縮小易感區(qū)域的范圍和最終確定候選易感基因。

2 針對(duì)罕見(jiàn)遺傳變異(Rare variant)的精細(xì)定位研究

GWAS常常是基于“常見(jiàn)疾病-常見(jiàn)變異”的假說(shuō)而開(kāi)展的。但是基于“常見(jiàn)疾病-罕見(jiàn)變異”假說(shuō)開(kāi)展的研究顯示,基因編碼區(qū)內(nèi)新近發(fā)生的罕見(jiàn)遺傳變異(MAF<1%)中富集了較多的有害變異,因此也能影響復(fù)雜疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[33]。例如,Dickson等[34]對(duì)耳聾 GWAS鑒定到的易感區(qū)域進(jìn)行重測(cè)序研究,發(fā)現(xiàn)該易感區(qū)域內(nèi)的罕見(jiàn)變異同樣可影響疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。Azzopardi等[35]對(duì)結(jié)直腸腺瘤的易感基因APC進(jìn)行重測(cè)序后發(fā)現(xiàn),在未攜帶已知常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)基因型的個(gè)體中,基因上多個(gè)罕見(jiàn)變異與患病風(fēng)險(xiǎn)具有顯著的相關(guān)性(P= 1.7 ×10–2)。

由于罕見(jiàn)變異產(chǎn)生的時(shí)間較短,在人群中的頻率很低,想要有效的發(fā)現(xiàn)這些變異需要比發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)變異更大的樣本量和更多的經(jīng)費(fèi)[36],這都極大地限制了對(duì)罕見(jiàn)變異的研究。例如,在一項(xiàng)對(duì)炎癥性腸病的70個(gè)已知易感基因的重測(cè)序研究中,在第一階段對(duì) 112個(gè)病例和 112個(gè)對(duì)照進(jìn)行重測(cè)序后,未發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著關(guān)聯(lián)的罕見(jiàn)變異,于是在第二階段擴(kuò)大樣本量,對(duì)896個(gè)病例和1216個(gè)對(duì)照進(jìn)行重測(cè)序,最終在IL23R基因上發(fā)現(xiàn)了p.Arg86Gln、p.Gly149Arg 和 p.Val362Ile與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著關(guān)聯(lián)的罕見(jiàn)變異[37]。

最近的研究結(jié)果顯示了罕見(jiàn)變異的一些新規(guī)律,包括下文中提及的罕見(jiàn)單體型攜帶罕見(jiàn)變異、罕見(jiàn)變異在疾病家系中具有較高的頻率和多個(gè)罕見(jiàn)變異具有累積效應(yīng)等。針對(duì)這些規(guī)律制定的研究策略不但有效地提高了檢測(cè)罕見(jiàn)變異的檢驗(yàn)效能,而且減少了需要研究的樣本量。

2.1 罕見(jiàn)單體型攜帶罕見(jiàn)變異

DNA序列中新的罕見(jiàn)變異可以與常見(jiàn)變異一起構(gòu)成新的單體型,這些單體型由于產(chǎn)生的時(shí)間較短,沒(méi)有足夠的時(shí)間傳播,所以在人群中的頻率小于1%。對(duì)與疾病相關(guān)聯(lián)的由常見(jiàn)變異構(gòu)成的罕見(jiàn)單體型進(jìn)行重測(cè)序,有可能在這些罕見(jiàn)單體型上發(fā)現(xiàn)致病的功能性罕見(jiàn)變異[38]。例如,Raychaudhuri等[39]對(duì)老年性黃斑變性GWAS鑒定的易感區(qū)域進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組中頻率為 0.048%的 H5單體型(CFH基因)能增加疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)該易感區(qū)域內(nèi)攜帶不同結(jié)構(gòu)單體型的 84個(gè)個(gè)體進(jìn)行重測(cè)序后發(fā)現(xiàn),攜帶H5單體型的6個(gè)個(gè)體在CFH基因的22號(hào)外顯子上均有一個(gè)能夠直接改變氨基酸的罕見(jiàn)變異R1210C(在人群中的頻率小于0.1%),而在其他攜帶非H5單體型的個(gè)體中均未發(fā)現(xiàn)該變異。通過(guò)上述研究策略,Raychaudhuri等成功地從罕見(jiàn)單體型上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與疾病易感性顯著關(guān)聯(lián)的罕見(jiàn)變異(P=9.4 × 10–3)。

2.2 罕見(jiàn)變異在疾病家系中具有較高的頻率

在家系中,各成員來(lái)源于共同的祖先,其中某一患者攜帶的致病變異可能會(huì)傳遞給下一代子女,并導(dǎo)致他們患病。因此,在普通人群中頻率較低的致病性罕見(jiàn)變異,在家系患病個(gè)體中會(huì)具有較高的頻率,從而更容易被發(fā)現(xiàn)并了解其遺傳模式。例如,Ewing等[40]在對(duì)前列腺癌易感區(qū)域17q21-22的研究中,發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的 rs138213197在5083個(gè)患者中的等位頻率為1.4%,在1401個(gè)對(duì)照個(gè)體中的頻率為0.1%。但是,在4個(gè)前列腺癌的大家系中該變異的頻率為 34%,在攜帶該變異的成員中有 82%的個(gè)體患病,大大高于在隨機(jī)人群中的比例。上述研究結(jié)果顯示,基于家系的研究策略在精細(xì)定位研究中可能更具有優(yōu)勢(shì)。

2.3 多個(gè)罕見(jiàn)變異具有累積效應(yīng)

因?yàn)楹币?jiàn)遺傳變異的發(fā)生具有隨機(jī)性,所以易感區(qū)域內(nèi)與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的罕見(jiàn)變異在不同的患病個(gè)體中可能發(fā)生在同一易感基因的不同外顯子上,對(duì)于這些罕見(jiàn)變異,主要通過(guò)負(fù)荷檢驗(yàn)(Burden test)來(lái)鑒定其所在的易感基因,同時(shí)鑒定它們與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)程度[2]。例如,對(duì)高脂血癥的易感基因ABCA1、APOA1和LCAT進(jìn)行重測(cè)序,對(duì)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)位于不同外顯子的新的罕見(jiàn)變異進(jìn)行了負(fù)荷檢驗(yàn),顯示與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著關(guān)聯(lián)(P<1.0×10–4)的罕見(jiàn)變異主要富集在ABCA1基因的不同外顯子上,這些罕見(jiàn)變異能夠直接改變ABCA1基因編碼的蛋白質(zhì),進(jìn)而降低血清中高密度脂蛋白的濃度,最終增加高脂血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[41]。

3 結(jié) 語(yǔ)

以SNP為遺傳標(biāo)記,采用GWAS的研究策略成功地發(fā)現(xiàn)了許多復(fù)雜疾病及其他性狀的易感基因區(qū)域。但是,目前也面臨著一些巨大挑戰(zhàn),包括缺乏快速、準(zhǔn)確和可重復(fù)使用的方法用于從這些易感基因區(qū)域中精確定位疾病的致病位點(diǎn)或致病基因,以及缺乏簡(jiǎn)單、流程化的功能研究方案用于闡明致病位點(diǎn)的生物學(xué)功能,這將是今后研究工作的瓶頸[2]。因此,應(yīng)用新的基因組序列檢測(cè)技術(shù)(如高通量測(cè)序)和采用更為有效的分析方法,在GWAS鑒定出的易感區(qū)域中精確定位與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)最顯著關(guān)聯(lián)的或致病性的遺傳變異,同時(shí)采用快速和流程化的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明其生物學(xué)功能,是后GWAS時(shí)代精細(xì)定位研究的主要內(nèi)容之一。

目前,針對(duì)常見(jiàn)變異的精細(xì)定位研究比較多。這類研究主要通過(guò)推斷或重測(cè)序增加SNP密度,尋找最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),并通過(guò)功能元件分析、eQTL分析和單體型分析等方法尋找功能性的 SNP位點(diǎn)和易感基因。隨著高通量測(cè)序成本的迅速降低,以及基因組功能元件的全面闡釋(例如 ENCODE計(jì)劃)[42],預(yù)計(jì)今后針對(duì)常見(jiàn)變異的精細(xì)定位研究將會(huì)更多的發(fā)現(xiàn)。另一方面,由于未受遺傳凈化選擇的制約和具有潛在的致病性功能[43],罕見(jiàn)變異在遺傳易感性中的作用在近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。今后研究的重要方向之一,將是在通過(guò)常見(jiàn)變異鑒定的候選易感基因組區(qū)域內(nèi)尋找致病性的罕見(jiàn)變異和易感基因。進(jìn)一步對(duì)所定位的常見(jiàn)變異或罕見(jiàn)變異進(jìn)行后續(xù)的功能驗(yàn)證,將是精細(xì)定位研究的關(guān)鍵所在。只有充分理解了這些變異的生物學(xué)意義,才能推動(dòng)對(duì)人類復(fù)雜疾病或性狀的遺傳機(jī)制的全面認(rèn)識(shí)。

此外,采用DNA序列的保守性[44]、基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[45]和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)[46]等策略對(duì)易感區(qū)域內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行研究,可以作為上述研究策略的有益補(bǔ)充。另有研究顯示,同義突變雖然不改變編碼的氨基酸,但是有可能通過(guò)三聯(lián)體核苷酸影響蛋白質(zhì)的合成速率,從而影響疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[47]。這提示,同義突變也可能是今后精細(xì)定位疾病易感基因研究領(lǐng)域的一個(gè)全新方向。

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