順鉑聯(lián)合吉西他濱對肺癌PD-1/PD-L1途徑的影響

孫德彬，留靜

(1.浙江省麗水市中心醫(yī)院 呼吸科，浙江 麗水323000;2.浙江省麗水市中心醫(yī)院 急診科，浙江 麗水323000)

在北美、東亞、東南亞，以及幾乎所有的歐洲國家，肺癌均是癌癥導致死亡的最常見原因之一［1-2］。資料表明，我國已成為世界肺癌發(fā)病率和死亡率最高的國家［3］，近年來國內(nèi)大中城市男性中肺癌的發(fā)病率已占所有惡性腫瘤的首位，女性也已升到第二位，僅次于乳腺癌;肺癌的死亡率也已成為男、女性因患惡性腫瘤死亡的第一、二病因［4］。對于肺癌的治療，有研究報道采用術前單療程化療可提高術后生存率［5］。因此，本研究采用順鉑及吉西他濱進行術前化療，研究其對PD-1/PD-L1途徑的影響，以期為肺癌的臨床治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2013年12月就診于麗水市中心醫(yī)院院且經(jīng)病理學確診的80例肺癌患者及10例良性肺部疾病患者(E組)，80例肺癌患者的預計生存期超過6個月，將肺癌患者隨機分為4組，即未經(jīng)化療藥物治療組(A組)、順鉑治療組(B組)、吉西他濱治療組(C組)和順鉑聯(lián)合吉西他濱治療組(D)組，每組20例。本實驗得到所有患者知情同意，及醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法:A組給予常規(guī)治療，B組在常規(guī)治療的基礎上采用30mg/m2靜脈滴注順鉑注射液(云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，國藥準字H20043889，規(guī)格:6mL/30mg)，1次/d，治療4周;C組按1 000mg/m2靜脈滴注吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國藥準字 H20030104，規(guī)格:0.2 g)30 min，1次/周，連用3周休1周，治療周期為4周;D組每天給予30mg/m2靜脈滴注順鉑注射液，且1次/周 1 000mg/m2靜脈滴注吉西他濱30 min，連用3周休1周，治療周期為4周。

1.2.2 Western blot法檢測 PD-1、PD-L1的表達:收集 A、B、C、D、E組患者的手術切除組織，將少量組織塊用潔凈的剪刀剪碎，置于2mL勻漿器中，加入400μL裂解液(含10%PMSF)后于冰上進行充分勻漿，裂解30 min后轉入離心管中，4℃下12 000 r/min，離心5 min，取上清液，加入buffer，煮沸8 min后于－20℃保存。采用Western blot法檢測PD-1、PD-L1(購自Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)的表達。

1.2.3 流式細胞儀檢測PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達:采集B、C、D組治療前后外周血與健康體檢人員外周血(F組)，抗凝后加入20μL FITC標記的鼠抗人PD-L1(BD Pharmingen公司)，振蕩均勻后避光反應20 min，經(jīng)破膜劑處理后加入PE標記抗的人 CD68(eBioscience公司)，流式細胞儀檢測(美國BECKMAN公司)。

1.2.4 ELISA法檢測IL-2、IL-4和IL-10因子含量:采集B、C、D組治療前后外周血，室溫下自然凝固，離心收集上清液。以10例來本院體檢的健康人員外周血(F組)作對照，按照ELISA試劑盒說明書進行操作(北京方程生物科技有限公司提供)。測定各樣本吸光度值(OD值)，計算各組IL-2、IL-4和IL-10因子含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料比較 4組患者在年齡、性別和臨床分期上均無統(tǒng)計學差異(見表1)。

表1 患者臨床資料比較Tab.1 Clinical datas of the patients

2.2 PD-1/PD-L1在肺癌組織與正常組織中的表達 PD-1/PD-L1陽性表達率 A組為60.0%(12/20)，B組為35.0%(7/20)，C組為40.0%(8/20)，D 組為20.0%(4/20)，E組未見表達(0/10)。為了觀察PD-1/PD-L1在肺癌組織中的表達情況，本研究對A組與肺部良性疾病患者組(E組)進行比較，結果顯示:A組較E組陽性表達率升高，且差異具有顯著性(P＜0.01)。B、C、D組較 A組PD-1/PD-L1陽性表達率均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。B、C 2組差異無統(tǒng)計學意義，但D組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明PD-1/PD-L1在肺癌細胞免疫中起負性調(diào)節(jié)作用，順鉑和吉西他濱均可降低PD-1/PD-L1的陽性表達率，2者聯(lián)合應用效果更佳。

2.3 PD-1/PD-L1在肺癌組織中的表達量 PD-1/PD-L1在A組中表達量最高，B組和C組中表達顯著降低(P＜0.05)，在D組中表達進一步降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而E組中PD-1/PD-L1未見表達。B組和C組PD-1/PD-L1表達差異無統(tǒng)計學意義(見圖1)。表明順鉑和吉西他濱均可抑制肺癌組織中PD-1/PD-L1的表達，2者抑制效果無明顯差異，而聯(lián)合用藥可顯著降低PD-1/PD-L1的表達，較單獨用藥效果更佳。

圖1 各組PD-1/PD-L1的表達量*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與A組比較;#P＜0.05，與D組比較Fig.1 The expression of PD-1/PD-L1 in each group*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with group A;#P＜0.05，compared with group D

2.4 肺癌患者外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達如圖2和圖3，B、C、D和F組中均可檢測到PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達，但B、C和D組中PD-L1+CD68+巨噬細胞的比例顯著高于F組(P＜0.01)。B組和C組均可降低PD-L1+CD68+巨噬細胞的比例(P＜0.05)，而D組PD-L1+CD68+巨噬細胞比例顯著下調(diào)(P＜0.01)。

圖2 流式細胞儀檢測PD-L1+CD68+巨噬細胞Fig.2 PD-L1+CD68+macrophages detected by flow cytometry

圖3 肺癌患者和對照組外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達情況比較##P＜0.01，與F組比較;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與治療前比較;ΔP＜0.05，與D組治療后比較Fig.3 Comparison on the expression of PD-L1+CD68+in peripheral blood of lung cancer patients and controls##P＜0.01，compared with F group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with pre-therapy group;ΔP＜0.05，compared with post-therapy in D group.

2.5 患者外周血血清中IL-2、IL-4和IL-10的釋放 ELISA結果顯示:B、C、D組治療前外周血血清中IL-2和IL-4含量較F組低(P＜0.01)，IL-10含量較F組高(P＜0.01);治療后B、C組外周血血清中IL-2和IL-4的含量較治療前均有一定程度的上調(diào)(P＜0.05)，D組上升幅度最大(P＜0.01);B、C組IL-10含量較治療前有一定程度的下調(diào)(P＜0.05)，D組下調(diào)幅度最大(P＜0.01，見表2)。

表2 外周血血清中IL-2、IL-4和IL-10的釋放(pg/mL)Fig.2 Release of IL-2，IL-4 and IL-10 in peripheral blood serum(pg/mL)

3 討論

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1在多種腫瘤的免疫耐受和免疫逃逸發(fā)生機制中發(fā)揮著重要的作用，如食管癌［6］、肝癌［7］、胃癌［8］、乳腺癌［9］等均中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且能抑制T、B細胞的增殖和功能，推測其可能參與了腫瘤免疫的負性調(diào)節(jié)，從而受到了研究人員廣泛的重視。不僅如此，另有臨床資料顯示，PD-L1也可以作為某些腫瘤臨床治療效果的參考指標［10］。PD(programmed death-1)因參與了細胞的凋亡，而被命名為程序性死亡-1受體。PD-L1是PD-1的一個配體，2者在活化的T細胞表面相結合后，可通過誘導細胞凋亡和阻止細胞周期的進程而抑制T細胞的免疫反應，使腫瘤細胞逃離機體的免疫應答反應。

然而，PD-1/PD-L1在肺癌組織及正常肺部組織的表達如何，其是否參與肺癌細胞的的免疫逃逸，鮮見報道。本研究結果顯示，PD-1/PD-L1在正常肺部組織(E組)中未見表達，而肺癌組織中陽性表達率高達57.1%，由此可推測PD-1/PD-L1途徑可能參與了肺癌細胞免疫逃逸。由于本研究肺部正常組織的例數(shù)少于肺癌組織，因此是否會對試驗結果又一定影響有待于今后進一步研究。

為探索順鉑聯(lián)合吉西他濱對PD-1/PD-L1表達的影響，本研究引入順鉑和吉西他濱單獨治療組作對照，結果顯示順鉑聯(lián)合吉西他濱較單獨用藥下調(diào)PD-1/PD-L1的陽性表達率及表達量更加顯著，提示順鉑聯(lián)合吉西他濱可能對恢復肺癌細胞的免疫應答有一定的作用，且效果較單獨用藥明顯。

有研究報道，肺癌組織和外周血中可檢測到PD-L1陽性表達的巨噬細胞［11］，其與預后差和生存期短密切相關［12］。本研究表明，肺癌患者外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞陽性表達率較正常人(F組)高，經(jīng)順鉑及吉西他濱治療后其表達率有所降低，且聯(lián)合用藥降低效果更加明顯。表明順鉑聯(lián)合吉西他濱治療肺癌效果更佳。

另外，PD-1/PD-L1信號途徑介導惡性腫瘤的免疫抑制，PD-L1可通過抑制CD4+，CD8+細胞的活化［13-14］，增加IL-10因子的分泌，抑制IL-2、IL-4的分泌［15］，從而使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。本研究表明順鉑及吉西他濱均可升高IL-2、IL-4的分泌，抑制IL-10的分泌，而聯(lián)合用藥效果更加明顯。

綜上，PD-1/PD-L1可能在肺癌細胞免疫逃逸發(fā)揮著重要作用，順鉑聯(lián)合吉西他濱可下調(diào)肺癌組織中PD-1/PD-L1的陽性表達率及表達量，降低PD-L1+CD68+巨噬細胞陽性表達，恢復PD-L1對IL-2、IL-4，IL-10所產(chǎn)生的影響，較單獨用藥效果明顯。該研究為肺癌的臨床靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

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