孫德彬,留靜
(1.浙江省麗水市中心醫(yī)院 呼吸科,浙江 麗水323000;2.浙江省麗水市中心醫(yī)院 急診科,浙江 麗水323000)
在北美、東亞、東南亞,以及幾乎所有的歐洲國家,肺癌均是癌癥導致死亡的最常見原因之一[1-2]。資料表明,我國已成為世界肺癌發(fā)病率和死亡率最高的國家[3],近年來國內(nèi)大中城市男性中肺癌的發(fā)病率已占所有惡性腫瘤的首位,女性也已升到第二位,僅次于乳腺癌;肺癌的死亡率也已成為男、女性因患惡性腫瘤死亡的第一、二病因[4]。對于肺癌的治療,有研究報道采用術前單療程化療可提高術后生存率[5]。因此,本研究采用順鉑及吉西他濱進行術前化療,研究其對PD-1/PD-L1途徑的影響,以期為肺癌的臨床治療提供理論基礎。
1.1 臨床資料 選取2013年1月~2013年12月就診于麗水市中心醫(yī)院院且經(jīng)病理學確診的80例肺癌患者及10例良性肺部疾病患者(E組),80例肺癌患者的預計生存期超過6個月,將肺癌患者隨機分為4組,即未經(jīng)化療藥物治療組(A組)、順鉑治療組(B組)、吉西他濱治療組(C組)和順鉑聯(lián)合吉西他濱治療組(D)組,每組20例。本實驗得到所有患者知情同意,及醫(yī)院倫理委員會的批準。
1.2 方法
1.2.1 治療方法:A組給予常規(guī)治療,B組在常規(guī)治療的基礎上采用30mg/m2靜脈滴注順鉑注射液(云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司,國藥準字H20043889,規(guī)格:6mL/30mg),1次/d,治療4周;C組按1 000mg/m2靜脈滴注吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,國藥準字 H20030104,規(guī)格:0.2 g)30 min,1次/周,連用3周休1周,治療周期為4周;D組每天給予30mg/m2靜脈滴注順鉑注射液,且1次/周 1 000mg/m2靜脈滴注吉西他濱30 min,連用3周休1周,治療周期為4周。
1.2.2 Western blot法檢測 PD-1、PD-L1的表達:收集 A、B、C、D、E組患者的手術切除組織,將少量組織塊用潔凈的剪刀剪碎,置于2mL勻漿器中,加入400μL裂解液(含10%PMSF)后于冰上進行充分勻漿,裂解30 min后轉入離心管中,4℃下12 000 r/min,離心5 min,取上清液,加入buffer,煮沸8 min后于-20℃保存。采用Western blot法檢測PD-1、PD-L1(購自Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)的表達。
1.2.3 流式細胞儀檢測PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達:采集B、C、D組治療前后外周血與健康體檢人員外周血(F組),抗凝后加入20μL FITC標記的鼠抗人PD-L1(BD Pharmingen公司),振蕩均勻后避光反應20 min,經(jīng)破膜劑處理后加入PE標記抗的人 CD68(eBioscience公司),流式細胞儀檢測(美國BECKMAN公司)。
1.2.4 ELISA法檢測IL-2、IL-4和IL-10因子含量:采集B、C、D組治療前后外周血,室溫下自然凝固,離心收集上清液。以10例來本院體檢的健康人員外周血(F組)作對照,按照ELISA試劑盒說明書進行操作(北京方程生物科技有限公司提供)。測定各樣本吸光度值(OD值),計算各組IL-2、IL-4和IL-10因子含量。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析,正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示,采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 患者一般資料比較 4組患者在年齡、性別和臨床分期上均無統(tǒng)計學差異(見表1)。
表1 患者臨床資料比較Tab.1 Clinical datas of the patients
2.2 PD-1/PD-L1在肺癌組織與正常組織中的表達 PD-1/PD-L1陽性表達率 A組為60.0%(12/20),B組為35.0%(7/20),C組為40.0%(8/20),D 組為20.0%(4/20),E組未見表達(0/10)。為了觀察PD-1/PD-L1在肺癌組織中的表達情況,本研究對A組與肺部良性疾病患者組(E組)進行比較,結果顯示:A組較E組陽性表達率升高,且差異具有顯著性(P<0.01)。B、C、D組較 A組PD-1/PD-L1陽性表達率均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。B、C 2組差異無統(tǒng)計學意義,但D組與B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明PD-1/PD-L1在肺癌細胞免疫中起負性調(diào)節(jié)作用,順鉑和吉西他濱均可降低PD-1/PD-L1的陽性表達率,2者聯(lián)合應用效果更佳。
2.3 PD-1/PD-L1在肺癌組織中的表達量 PD-1/PD-L1在A組中表達量最高,B組和C組中表達顯著降低(P<0.05),在D組中表達進一步降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而E組中PD-1/PD-L1未見表達。B組和C組PD-1/PD-L1表達差異無統(tǒng)計學意義(見圖1)。表明順鉑和吉西他濱均可抑制肺癌組織中PD-1/PD-L1的表達,2者抑制效果無明顯差異,而聯(lián)合用藥可顯著降低PD-1/PD-L1的表達,較單獨用藥效果更佳。
圖1 各組PD-1/PD-L1的表達量*P<0.05,**P<0.01,與A組比較;#P<0.05,與D組比較Fig.1 The expression of PD-1/PD-L1 in each group*P<0.05,**P<0.01,compared with group A;#P<0.05,compared with group D
2.4 肺癌患者外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達如圖2和圖3,B、C、D和F組中均可檢測到PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達,但B、C和D組中PD-L1+CD68+巨噬細胞的比例顯著高于F組(P<0.01)。B組和C組均可降低PD-L1+CD68+巨噬細胞的比例(P<0.05),而D組PD-L1+CD68+巨噬細胞比例顯著下調(diào)(P<0.01)。
圖2 流式細胞儀檢測PD-L1+CD68+巨噬細胞Fig.2 PD-L1+CD68+macrophages detected by flow cytometry
圖3 肺癌患者和對照組外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞的表達情況比較##P<0.01,與F組比較;*P<0.05,**P<0.01,與治療前比較;ΔP<0.05,與D組治療后比較Fig.3 Comparison on the expression of PD-L1+CD68+in peripheral blood of lung cancer patients and controls##P<0.01,compared with F group;*P<0.05,**P<0.01,compared with pre-therapy group;ΔP<0.05,compared with post-therapy in D group.
2.5 患者外周血血清中IL-2、IL-4和IL-10的釋放 ELISA結果顯示:B、C、D組治療前外周血血清中IL-2和IL-4含量較F組低(P<0.01),IL-10含量較F組高(P<0.01);治療后B、C組外周血血清中IL-2和IL-4的含量較治療前均有一定程度的上調(diào)(P<0.05),D組上升幅度最大(P<0.01);B、C組IL-10含量較治療前有一定程度的下調(diào)(P<0.05),D組下調(diào)幅度最大(P<0.01,見表2)。
表2 外周血血清中IL-2、IL-4和IL-10的釋放(pg/mL)Fig.2 Release of IL-2,IL-4 and IL-10 in peripheral blood serum(pg/mL)
近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1在多種腫瘤的免疫耐受和免疫逃逸發(fā)生機制中發(fā)揮著重要的作用,如食管癌[6]、肝癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]等均中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),且能抑制T、B細胞的增殖和功能,推測其可能參與了腫瘤免疫的負性調(diào)節(jié),從而受到了研究人員廣泛的重視。不僅如此,另有臨床資料顯示,PD-L1也可以作為某些腫瘤臨床治療效果的參考指標[10]。PD(programmed death-1)因參與了細胞的凋亡,而被命名為程序性死亡-1受體。PD-L1是PD-1的一個配體,2者在活化的T細胞表面相結合后,可通過誘導細胞凋亡和阻止細胞周期的進程而抑制T細胞的免疫反應,使腫瘤細胞逃離機體的免疫應答反應。
然而,PD-1/PD-L1在肺癌組織及正常肺部組織的表達如何,其是否參與肺癌細胞的的免疫逃逸,鮮見報道。本研究結果顯示,PD-1/PD-L1在正常肺部組織(E組)中未見表達,而肺癌組織中陽性表達率高達57.1%,由此可推測PD-1/PD-L1途徑可能參與了肺癌細胞免疫逃逸。由于本研究肺部正常組織的例數(shù)少于肺癌組織,因此是否會對試驗結果又一定影響有待于今后進一步研究。
為探索順鉑聯(lián)合吉西他濱對PD-1/PD-L1表達的影響,本研究引入順鉑和吉西他濱單獨治療組作對照,結果顯示順鉑聯(lián)合吉西他濱較單獨用藥下調(diào)PD-1/PD-L1的陽性表達率及表達量更加顯著,提示順鉑聯(lián)合吉西他濱可能對恢復肺癌細胞的免疫應答有一定的作用,且效果較單獨用藥明顯。
有研究報道,肺癌組織和外周血中可檢測到PD-L1陽性表達的巨噬細胞[11],其與預后差和生存期短密切相關[12]。本研究表明,肺癌患者外周血中PD-L1+CD68+巨噬細胞陽性表達率較正常人(F組)高,經(jīng)順鉑及吉西他濱治療后其表達率有所降低,且聯(lián)合用藥降低效果更加明顯。表明順鉑聯(lián)合吉西他濱治療肺癌效果更佳。
另外,PD-1/PD-L1信號途徑介導惡性腫瘤的免疫抑制,PD-L1可通過抑制CD4+,CD8+細胞的活化[13-14],增加IL-10因子的分泌,抑制IL-2、IL-4的分泌[15],從而使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。本研究表明順鉑及吉西他濱均可升高IL-2、IL-4的分泌,抑制IL-10的分泌,而聯(lián)合用藥效果更加明顯。
綜上,PD-1/PD-L1可能在肺癌細胞免疫逃逸發(fā)揮著重要作用,順鉑聯(lián)合吉西他濱可下調(diào)肺癌組織中PD-1/PD-L1的陽性表達率及表達量,降低PD-L1+CD68+巨噬細胞陽性表達,恢復PD-L1對IL-2、IL-4,IL-10所產(chǎn)生的影響,較單獨用藥效果明顯。該研究為肺癌的臨床靶向治療提供一定的理論依據(jù)。
[1]Jemal A,Thun MJ,Ries LA,etal.Annual report to the nation on the status of cancer,1975-2005,featuring trends in lung cancer,tobacco use,and tobacco control[J].J Natl Cancer Inst,2008,100(23):1672-1694.
[2]Boyle P,Smans M,editors.Atlas of cancer mortality in the European Union and the European economic area 1993-1997[J].IARCSci Publ,2008(159):1-259.
[3]Rivera MP.Multimodality therapy in the treatment of lung cancer[J].Semin Respir Crit Care Med,2004(1):3-10.
[4]Chen W,Zheng R,Zhang S,etal.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1):48-58.
[5]張澤峰,高峰,王濤,等.術前單療程化療治療ⅢA期非小細胞肺癌的療效觀察[J].中國生化藥物雜志,2012(4):484-486.
[6]Tomimaru Y,Yano M,Takachi K,etal.Correlation between pretherapeutic d-dimer levels and response to neoadjuvant chemotherapy in patients with advanced esophageal cancer[J].Dis Esophagus,2008,21(4):281-287.
[7]PanXC,Li L,Mao JJ,etal.Synergistic effects of soluble PD-1 and IL-21 on antitumor immunity against H22 murine hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett,2013,5(1):90-96.
[8]Savabkar S,Azimzadeh P,Chaleshi V,etal.Programmed death-1 gene polymorphism(PD-1.5 C/T)is associated with gastric cancer[J].Gastroenterol Hepatol Bed Bench,2013,6(4):178-182.
[9]Muenst S,Soysal SD,Gao F,etal.The presence of programmed death 1(PD-1)-positive tumor-infiltrating lymphocytes is associated with poor prognosis in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2013,139(3):667-676.
[10]Duraiswamy J,F(xiàn)reeman GJ,Coukos G.Therapeutic PD-1 pathway blockade augments with other modalities of immunotherapy T-cell function to prevent immune decline in ovarian cancer[J].Cancer Res,2013,73(23):6900-6912.
[11]Dong H,Strome SE,Salomao DR,etal.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med,2002(8):793-800.
[12]陳延斌.PD-L1/PD-1在非小細胞肺癌中的臨床應用研究[D].蘇州大學,2011.
[13]Bos PD,Plitas G,Rudra D,etal.Transient regulatory T cell ablation deters oncogene-driven breast cancer and enhances radiotherapy[J].J Exp Med,2013,210(11):2435-2466.
[14]Kearl TJ,Jing W,Gershan JA,etal.Programmed death receptor-1/programmed death receptor ligand-1 blockade after transient lymphodepletion to treat myeloma[J].J Immunol,2013,190(11):5620-5628.
[15]Maine CJ,Aziz NH,Chatterjee J,etal.Programmed death ligand-1 overexpression correlates with malignancy and contributes to immune regulation in ovarian cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(3):215-224.