雌三醇及拮抗劑三苯氧胺對(duì)兔耳瘢痕增生的影響

竇孝康

(黔西南州人民醫(yī)院 普外燒傷科，貴州 興義 562400)

瘢痕是因物理、生物、化學(xué)等因素的作用導(dǎo)致皮膚軟組織損傷而不能完全自行正常修復(fù)，轉(zhuǎn)由纖維組織替代修復(fù)遺留的病理狀態(tài)。適度的瘢痕形成是一種生理性和自衛(wèi)性表現(xiàn)，而過度增生則屬于病理狀況。瘢痕組織的生成包括3個(gè)步驟:①肉芽組織形成將創(chuàng)腔填滿，創(chuàng)面鋪墊平整。②創(chuàng)緣的向心性收縮，牽拉四周正常皮膚向內(nèi)移動(dòng)使邊緣互相接近。③上皮再生，源于創(chuàng)面的皮膚表皮的新生上皮細(xì)胞向創(chuàng)面中心聚攏推進(jìn)，逐漸覆蓋肉芽組織，形成皮膚瘢痕，創(chuàng)面最終愈合。從病理學(xué)角度可將瘢痕分為3類:正常皮膚瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。后2者均屬于病理性增生，其發(fā)生機(jī)制至今仍不明確，因此難以有效治療。目前的治療方式有通過加壓、藥物、放射、激光、冷凍、中醫(yī)藥手術(shù)等，但沒有一種方法能完全地避免或消除瘢痕。

近年來由于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)瘢痕的研究取得了一定進(jìn)展，尤其是一些與瘢痕相關(guān)的生長(zhǎng)因子及信號(hào)傳導(dǎo)通路的發(fā)現(xiàn)，為治療瘢痕提供了新的思路。在眾多細(xì)胞因子中，TGFβ因與瘢痕增生關(guān)系密切，一直是研究的熱點(diǎn)之一。本研究旨在通過構(gòu)建兔耳瘢痕模型，采用雌三醇作為瘢痕增生的促進(jìn)劑并以三苯氧胺作為拮抗劑，通過大體標(biāo)本的觀察、HE染色及免疫組化方法，觀察其對(duì)兔耳瘢痕模型的影響，探索雌三醇與瘢痕增生、三苯氧胺抑制瘢痕增生的關(guān)系，以及對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳兔24只，體質(zhì)量為2.2～2.8 kg，兔齡在2～4月，均為雌性，分籠人工飼料飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)2001A032)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兔瘢痕模型構(gòu)建:將大耳兔隨機(jī)分成3組:雌三醇組、三苯氧胺組、對(duì)照組。每只兔耳制作6個(gè)直徑1.2 cm圓形標(biāo)記，間隔約1 cm。24只兔子共制作288個(gè)創(chuàng)面。2周后，兔耳打孔處出現(xiàn)圓形瘢痕，為兔瘢痕模型構(gòu)建成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)給藥:雌三醇組用雌三醇乳膏(默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20091091)外涂。涂抹劑量為每孔為0.0015mg，每天1次;三苯氧胺組除用以同樣劑量雌三醇乳膏外涂外加用三苯氧胺(楊子江制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32021472)，10mg/d喂服;對(duì)照組未用藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)采集

1.3.1 各組標(biāo)本中瘢痕形態(tài):麻醉后切取每只兔左耳外側(cè)近耳尖部第一個(gè)瘢痕組織以4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。觀察并拍照，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組瘢痕的表面、質(zhì)地、厚度、色澤及是否有皮釘存在。

1.3.2 瘢痕指數(shù)的測(cè)定:將HE染色石蠟切片放置于光鏡下，在100倍鏡下用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量創(chuàng)面上皮化后的真皮厚度和鄰近正常組織的真皮厚度，計(jì)算瘢痕指數(shù)，按照下列公式［2］。

1.3.3 免疫組化結(jié)果分析:瘢痕組織中含大量TGF-β1，在成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中呈現(xiàn)棕黃色或紅褐色為陽(yáng)性表達(dá)。選用染色細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度綜合評(píng)分方法(IHS法)［3］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0分析處理數(shù)據(jù)，正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表達(dá)，其中兩兩間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔瘢痕模型建立 24只兔子共制作288個(gè)創(chuàng)面(圖1左)。2周后，所有創(chuàng)面均愈合，上皮化完成，兔耳打孔處出現(xiàn)了圓形瘢痕，288處創(chuàng)面均出現(xiàn)瘢痕，無流膿流液(圖1右)。

圖1 兔瘢痕模型構(gòu)建Fig.1 Construction of rabbit hypertrophic scars model

2.2 術(shù)后2周標(biāo)本中呈現(xiàn)的瘢痕增生情況

2.2.1 大體標(biāo)本:2周后觀察3組瘢痕大體標(biāo)本，雌激素組瘢痕稍高出皮膚表面，質(zhì)地中，色澤偏紅;苯氧胺組、對(duì)照組瘢痕情況同雌激素組(見圖2)。3組的表面、質(zhì)地、色澤、厚度、直徑及皮釘數(shù)目無明顯差異(見表1)。

圖2 3組瘢痕增生情況比較Fig.2 Comparasion of scar hyperplasia among three groups

表1 3組瘢痕大體標(biāo)本表現(xiàn)Tab.1 Performance of scar gross in three groups

2.2.2 術(shù)后2周3組瘢痕指數(shù)測(cè)定結(jié)果:雌激素組測(cè)量的瘢痕指數(shù)為1.55±0.34;三苯氧胺組測(cè)量的瘢痕指數(shù)為1.66±0.18，空白對(duì)照組測(cè)量的瘢痕指數(shù)為1.49±0.25。3組瘢痕指數(shù)兩兩比較均無顯著性差異。

2.2.3 術(shù)后2周3組瘢痕組織光鏡下HE染色結(jié)果:光鏡結(jié)果顯示:3組均有成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維沉積，并可見淋巴細(xì)胞、槳細(xì)胞以及中性細(xì)胞浸潤(rùn)，比較無顯著性差異(見圖3)。

圖3 術(shù)后2周3組瘢痕組織光鏡下HE染色結(jié)果(×400)Fig.3 HE staining results of scar tissue in three groups posrview at 2 weeks(×400)

2.2.4 3組瘢痕組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果:TGF-β1主要在成纖維細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，雌激素組、三苯氧胺組及對(duì)照組的TGF-β1在兔耳瘢痕中均多呈低表達(dá)反應(yīng)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)很少(見圖4)。TGF-β1在各組瘢痕中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)及積分情況見表2。

圖4 3組瘢痕組織TGF-β1免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical detection results of TGF-beta 1 in scar tissues of three groups

表2 二周時(shí)TGF-β1在各組瘢痕中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況以及IHS在各組的積分Tab.2 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after two weeks

2.3 術(shù)后5周3組標(biāo)本中呈現(xiàn)的瘢痕增生情況

2.3.1 術(shù)后5周3組瘢痕大體情況:雌激素組可見瘢痕明顯高出于皮膚表面，增生比較明顯，表現(xiàn)為質(zhì)地較硬，色澤偏紅，大部分創(chuàng)面中央?yún)^(qū)出現(xiàn)較大皮釘，而三苯氧胺組瘢痕與皮膚表面相平，增生不明顯，表現(xiàn)為質(zhì)地軟，色澤偏淡，皮釘數(shù)目少而且較小，對(duì)照組瘢痕與三苯氧胺組類似(見圖5)。瘢痕大體表現(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表3。

圖5 術(shù)后5周3組瘢痕大體情況Fig.5 General situation of scar in three groups posrview at 5 weeks

表3 瘢痕大體表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)表Tab.3 Performance of scar gross in three groups

2.3.2 術(shù)后5周瘢痕指數(shù)的測(cè)定:雌激素組瘢痕明顯高過周圍皮膚表面，瘢痕指數(shù)為2.25±0.34;三苯氧胺組瘢痕較為扁平，瘢痕指數(shù)為1.64±0.25;空白對(duì)照組瘢痕也呈現(xiàn)為扁平瘢痕表現(xiàn)，瘢痕指數(shù)為1.09±0.18。雌激素組瘢痕指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。三苯氧胺瘢痕指數(shù)顯著低于雌激素組(P＜0.05)。

2.3.3 術(shù)后5周3組瘢痕組織HE染色結(jié)果:雌激素組瘢痕組織中膠原纖維增多，排列雜亂，血管數(shù)目增多，成纖維細(xì)胞大量增多，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞以及中性白細(xì)胞增多。三苯氧胺組瘢痕組織中膠原纖維減少，成纖維細(xì)胞較少，血管數(shù)目少，排列整齊，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞以及中性白細(xì)胞減少。對(duì)照組介于2者之間(見圖6)。

圖6 術(shù)后5周3組瘢痕組織HE染色結(jié)果(×400)Fig.6 HE staining results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks(×400)

2.3.4 術(shù)后5周3組瘢痕組織免疫組化結(jié)果:雌激素組TGF-β1在兔耳瘢痕中呈高表達(dá)，在三苯氧胺組及對(duì)照組中均呈低表達(dá)(見圖7)。TGF-β1在各組瘢痕中的陽(yáng)性表達(dá)情況及程度見表4。

圖7 術(shù)后5周3組瘢痕組織免疫組化結(jié)果Fig.7 Immunohistochemical results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks

表4 5周時(shí)TGF-β1在各組瘢痕中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況以及IHS在各組的積分Tab.4 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after 5 weeks

3 討論

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:雌三醇乳膏對(duì)兔耳瘢痕有促進(jìn)增生的作用，并與TGF-β1表達(dá)同步。三苯氧胺可以抑制雌三醇引起的兔耳瘢痕增生。三苯氧胺組與對(duì)照組比較，除TGF-β1表達(dá)明顯少于對(duì)照組外，2組其他結(jié)果均接近，是否三苯氧胺除阻止雌激素刺激瘢痕增生外還有其他抑制瘢痕增生的機(jī)制呢?目前尚不能下定論。雌三醇對(duì)兔耳增生性瘢痕模型的建立與改進(jìn)有重要意義。

雌激素屬脂溶性激素，可以透過細(xì)胞膜，經(jīng)細(xì)胞質(zhì)、再經(jīng)過核膜而進(jìn)入核內(nèi)，以核蛋白作為受體，直接在染色質(zhì)上改變受體的構(gòu)象而發(fā)揮作用［4-5］。雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜和平滑肌的代謝有明顯促進(jìn)作用。刺激陰道上皮基底層細(xì)胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密變化，刺激人類乳腺導(dǎo)管的生長(zhǎng)和乳腺腺泡的發(fā)育［6-7］。

三苯氧胺在兔耳瘢痕增生中主要表現(xiàn)為抑制作用，它可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并且還能抑制膠原的沉積。李兵等［8］和胡大海等［9］報(bào)告顯示三苯氧胺還可以抑制瘢痕成纖維細(xì)胞DNA及膠原的合成。本實(shí)驗(yàn)中，三苯氧胺組對(duì)瘢痕也同樣表現(xiàn)出抑制作用，大體標(biāo)本表現(xiàn)為瘢痕厚度變薄、質(zhì)地變軟、色澤偏暗、皮釘數(shù)目較少;光鏡下表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞數(shù)目較雌激素少，膠原沉積少;免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1呈現(xiàn)低表達(dá)，IHS積分較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，有多種細(xì)胞分泌非活性狀態(tài)的TGF-β，非活性狀態(tài)的TGF-β通過酸化可被活化。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3 種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1、TGF-β2與瘢痕增生有密切關(guān)系。TGF-β1能夠加速成纖維細(xì)胞增殖，刺激膠原等胞外基質(zhì)的沉積，趨化巨噬細(xì)胞向傷口聚集，誘導(dǎo)肉芽組織的生長(zhǎng)，在促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)以及修復(fù)后組織改建過程中起重要作用。從本次免疫組化結(jié)果可見:TGF-β1在雌三醇組的表達(dá)明顯高于三苯氧胺組及對(duì)照組，呈現(xiàn)高表達(dá)反應(yīng)，表現(xiàn)在成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)為多量、成片的棕黃色，并能見到大量的膠原沉積，說明雌激素導(dǎo)致的瘢痕增生與TGF-β1有關(guān)。而在三苯氧胺組TGF-β1呈現(xiàn)低表達(dá)反應(yīng)，在成纖維細(xì)胞分布區(qū)域表現(xiàn)為少量，小片狀棕黃色，且膠原沉積較少，說明TGF-β1減少與瘢痕抑制有一定的相關(guān)性。

除此之外，兔耳瘢痕模型制作對(duì)于研究瘢痕形成、發(fā)展、增生有重要意義，雖已有許多研究，但目前仍以兔耳瘢痕模型為佳，本實(shí)驗(yàn)可見局部使用雌三醇乳膏可導(dǎo)致明顯的增生現(xiàn)象，而三苯氧胺能抑制雌激素引起的兔耳瘢痕增生。然而是否可將在局部使用雌激素作為制作增生性瘢痕模型的方法是值得商榷的。本實(shí)驗(yàn)不足在于樣本例數(shù)少、時(shí)間短，檢測(cè)指標(biāo)較簡(jiǎn)單，進(jìn)一步結(jié)論還有待后續(xù)研究。

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