運(yùn)動對肥胖大鼠脂肪細(xì)胞線粒體含量、活性及有氧代謝相關(guān)基因的影響

陳 平，郭艷華，劉文景，陰乃應(yīng)，孫 劍

（1.呂梁學(xué)院 體育系，山西 呂梁 033000；2.新疆師范大學(xué) 體育學(xué)院，烏魯木齊 830000）

隨著我國居民高脂高能量飲食習(xí)慣的形成，居民普遍攝入總能量增多，再加上生活方式和生活節(jié)奏的改變，靜坐增多，日常性的身體活動與主動的體育鍛煉急劇減少，導(dǎo)致我國無論是青少年還是成人的超重、肥胖檢出率逐年提高。而肥胖是引發(fā)高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、糖尿病、阿爾茨海默氏癥以及中風(fēng)等代謝性疾病的獨立危險因素［1］。因此，健康降脂已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)界和生物科學(xué)界的研究熱點問題。線粒體被認(rèn)為是生物體內(nèi)的“能量工廠”，是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的核心細(xì)胞器，對于機(jī)體內(nèi)能量平衡的維持十分重要［2］。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖動物以及人類脂肪組織中線粒體DNA 拷貝數(shù)表達(dá)降低、線粒體的基因表達(dá)也較少；PCKB小鼠與C57 黑鼠（常用來研究糖尿病和肥胖癥）雜交后，篩選得到PCKB缺乏的雜交小鼠比一般小鼠吃得更多，體重卻比一般小鼠更輕，脂肪也少得多，但脂肪細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量增多，氧氣消耗增多［3］。實驗表明，在習(xí)慣久坐的肥胖成人中，對他們實施減體重和體育鍛煉的聯(lián)合干預(yù)后，其骨骼肌中的線粒體數(shù)量增加，體積擴(kuò)大［4］；長時間耐力運(yùn)動使大鼠骨骼肌線粒體的形態(tài)分布以及數(shù)量維持在適宜的動態(tài)平衡中［5］。那么，有氧運(yùn)動是否會通過提高脂肪細(xì)胞線粒體的含量／活性以及氧化呼吸功能，從而達(dá)到控制體重的效用，鮮見報道。本研究旨在觀察有氧運(yùn)動后肥胖大鼠脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)量及氧化呼吸功能的變化，以此探索有氧運(yùn)動減肥的可能分子依據(jù)，為有氧運(yùn)動能夠降低體重提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

5周齡健康雄性SD 大鼠34 只，體重145—165g，隨機(jī)分為對照組（HC，8 只）和高脂飲食組（HF，26 只），對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)。自由攝食和飲水，室內(nèi)平均溫度21—23 ℃，相對濕度45%—55%，每日光照12 h。每周稱體重一次，喂養(yǎng)12周。

普通飼料為常規(guī)嚙齒類動物飼料。而高脂肪飼料為每100克普通飼料中加入全脂奶粉15g、豬油5g、黃肚豆15 g、雞蛋黃50g、魚肝油10滴、牛膽酸納0.5g。

第12周末，選取體重超出正常對照組平均體重20%的大鼠16只，再隨機(jī)分為肥胖對照組（OB）、運(yùn)動組（E＋OB），每組8只。運(yùn)動組大鼠除給予普通飼料喂養(yǎng)外，每天上午在流動水游泳池內(nèi)無負(fù)重游泳1次。游泳池100cm×80cm×50cm，水速在前4周為1.4m／s，后4周為2m／s，水溫24—25 ℃，訓(xùn)練前進(jìn)行5天適應(yīng)性游泳運(yùn)動，持續(xù)時間為30min／次，之后每周訓(xùn)練5天（周六、日不訓(xùn)練），1次／d，60min／次，連續(xù)訓(xùn)練8周。所有大鼠均在游泳組大鼠最后一次訓(xùn)練24h后處死。

1.2 樣本的采集

隔夜禁食后將大鼠稱重（BW），用2%戊巴比妥納（3 ml／kg）麻醉，斷頭處死大鼠，迅速取肩胛間區(qū)脂肪組織、睪周脂肪組織及腹膜后脂肪組織，用銳利眼科剪將腹膜后脂肪組織標(biāo)本剪成2 mm×2 mm×2 mm 左右的脂肪組織塊，一部分經(jīng)37 ℃預(yù)熱的PBS沖洗3次，4%的甲醛固定；另一部分－80 ℃冰箱保存。

1.3 線粒體含量測定

用普利萊法測定脂肪組織線粒體含量［6］。取固定后的脂肪組織塊用PBS沖洗5次，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃孵育5—10min，冰上研磨后，轉(zhuǎn)入離心管，800rpm 離心5分鐘后，收集上清離心12 000rpm 再次離心10 min，按照BCA 蛋白定量試劑盒的說明書步驟進(jìn)行線粒體含量測定。

1.4 ATP含量測定

ATP含量測定采用ATP測定試劑盒，具體操作步驟參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。

1.5 COX 氧化酶活性測定

取脂肪組織塊與研磨器內(nèi)冰上研磨后，4 ℃環(huán)境下1 000r／min離心20 min，收集上清，按試劑盒說明書進(jìn)行COX 酶活性測定。

1.6 組織總RNA 提取及RT－PCR

采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)凝膠電泳顯示28S清晰條帶1 條，測定波長260nm、280nm 處的OD值，計算OD260／OD280 值和RNA 濃度，提取無污染無降解的RNAOD260／OD280值為1.8—2.0。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后采用熒光定量RT－PCR 法檢測腹膜后脂肪組織中Cytc mRNA、MDH mRNA、CPT1 mRNA 以及COX mRNA 表達(dá)水平。

從NCBI的nucleotide中查得目的基因和內(nèi)參照基因，聯(lián)系上海博亞生物技術(shù)有限公司設(shè)計上下游引物。引物序列如下：Cytc上游序列：5’CGAGTTCATGTACCGGGTCT3’，Cytc下游序列：5’CTGCGAGTGGTGGATTGT3’；MDH上游序列：5’ATGCCTTTGTTCTTGTTGG3’，MDH 下游序列：5’CCCCTTTCGCTTCTCCTG3’；CPT1 上游序列：5’ATGGTGGCGTTGGTGTTG3’，CPT1 下游序列：5’CCTTGTTGTCAGTTTGGGTAA3’；COX上游序列：5’AGGAAGGATTGGTGGAATG3’，COX下游序列：5’CTGAGCAGGAATAGTGGG3’；β－actin 上游序列：5’ACTGCCGCACTTCTCTTCCTC3’，β－actin 下游序列：5’CTCCTGCTTGCTGATCATC3’。退火溫度分別為57 ℃、58 ℃、56 ℃、56 ℃和56 ℃。電泳帶經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)（Wealtec）拍照并用凝膠分析軟件（Dophin－1D）分析。結(jié)果用特異基因和參考基因電泳帶吸光度比值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件分析，全部數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），選擇Homogeneity－of－variance顯示方差齊性，選擇Tukey比較各組間差異，P＜0.05表示組間差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體重、肩胛間區(qū)脂肪組織、睪周脂肪組織的比較

肥胖組大鼠的體重、睪周脂肪組織較對照組大鼠顯著增高，肩胛間區(qū)脂肪組織顯著降低；運(yùn)動組大鼠的體重、睪周脂肪組織較肥胖對照組大鼠顯著降低，肩胛間區(qū)脂肪組織顯著升高（表1、2和圖1）。

表1 第八周后大鼠體重變化的比較（±SD）n＝8

表1 第八周后大鼠體重變化的比較（±SD）n＝8

注：與正常組相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；與肥胖組相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

組別 第八周 第十周 第十二周 第十四周 第十六章 第十八章 第二十周對照組 457±12.80 472±15.83 474±12.19 480±22.38 490±24.33 522±25.11 526±23.17肥胖組 451±11.04 495±17.54＊＊ 555±21.31＊＊ 565±26.05＊＊ 595±28.54＊＊ 607±26.43＊＊ 624±34.52＊＊運(yùn)動組 451±10.47 495±13.67 555±23.42 558±21.56 545±27.17＃＃ 522±25.28＃＃ 509±28.45＃＃

圖1 第8周后大鼠體重的變化（±SD）

表2 大鼠肩胛間區(qū)脂肪組織、睪周脂肪組織的比較（±SD）n＝8

表2 大鼠肩胛間區(qū)脂肪組織、睪周脂肪組織的比較（±SD）n＝8

注：與正常組相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；與肥胖組相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

組別 肩胛間區(qū)脂肪組織／g 睪周脂肪組織／g對照組81.19±23.18 82.47±25.63肥胖組 79.01±14.32＊ 96.55±26.10＊＊運(yùn)動組 84.87±16.15＃ 84.94±19.73＃＃

2.2 線粒體含量、活性的比較

與對照組相比，肥胖組大鼠脂肪組織的線粒體含量、活性顯著降低；與肥胖組大鼠相比，運(yùn)動組大鼠脂肪組織中的線粒體含量、活性顯著升高（表3）。

表3 大鼠脂肪組織線粒體含量、活性以及COX 活性的比較（±SD）n＝8

表3 大鼠脂肪組織線粒體含量、活性以及COX 活性的比較（±SD）n＝8

注：與對照組相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；與肥胖組相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

組別 mt含量 ATP含量 COX 活性對照組1.75±0.29 8.05±1.72 3.81±0.97肥胖組 0.59±0.27＊＊ 6.93±1.34＊＊ 2.45±0.58＊＊運(yùn)動組 1.78±0.31＃＃ 7.88±1.49＃＃ 3.86±0.73＃＃

2.3 COX 活性變化

與對照組相比，肥胖組大鼠脂肪組織的COX 酶活性顯著降低；運(yùn)動組大鼠的COX 酶活性顯著升高（表3）。

2.4 有氧代謝相關(guān)基因表達(dá)水平

與對照組相比，肥胖組大鼠脂肪組織線粒體有氧代謝相關(guān)基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表達(dá)水平顯著降低；運(yùn)動組大鼠脂肪組織線粒體有氧代謝相關(guān)基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表達(dá)水平顯著升高（圖2、3、4、5和 表4）。

圖2 Cytc mRNA 在各組大鼠脂肪組織中的表達(dá)

圖3 CPT1mRNA 在各組大鼠脂肪組織中的表達(dá)

圖4 MDH mRNA 在各組大鼠脂肪組織中的表達(dá)

圖5 COX mRNA 在各組大鼠脂肪組織中的表達(dá)

表4 大鼠脂肪組織線粒體氧化代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的比較（±SD）

表4 大鼠脂肪組織線粒體氧化代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的比較（±SD）

注：與正常組相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；與肥胖組相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

組別 CPT1mRNA COX mRNA Cy tc mRNA MDH mRNA對照組 0.69±0.033 0.97±0.031 0.67±0.025 0.68±0.01 3肥胖組 0.54±0.017＊ 0.61±0.024＊＊ 0.51±0.021＊ 0.55±0.017＊運(yùn)動組 0.73±0.022＃＃ 0.91±0.027＃ 0.70±0.023＃＃ 0.73±0.026＃＃

3 討論

3.1 線粒體的形態(tài)、分布與功能特點

線粒體是真核細(xì)胞的一種重要的、高度動態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，形狀多種多樣，呈顆粒狀、棒狀或者線狀，并且彼此之間相互連接，形成一個動態(tài)的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。線粒體主要存在于心肌、骨骼肌、肝臟以及棕色脂肪組織等能量需求較高、代謝較強(qiáng)的組織中。它通過呼吸作用，將生物大分子諸如碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等氧化分解，從而產(chǎn)生能量，進(jìn)而為機(jī)體細(xì)胞的代謝活動供能［7］。研究表明，遺傳和環(huán)境因素在肥胖的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色，但無論是哪種因素，肥胖最終都表現(xiàn)為皮下脂質(zhì)積聚過多［8］。而脂肪細(xì)胞線粒體是脂肪酸β氧化的主要場所之一，是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的核心細(xì)胞器，對于維持脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝尤為重要，當(dāng)脂肪細(xì)胞線粒體功能發(fā)生障礙時，勢必會影響到脂肪酸的β氧化過程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸大量聚集，進(jìn)而抑制胰島素信號傳導(dǎo)通路，造成與肥胖有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［9］。因此，研究脂肪細(xì)胞線粒體功能，誘發(fā)脂肪細(xì)胞線粒體含量增生，提高脂肪細(xì)胞線粒體氧化呼吸活性，成為控制機(jī)體脂質(zhì)沉積的熱點問題。

3.2 線粒體與肥胖

肥胖是一種代謝性疾病，其發(fā)生的根本原因是能量代謝失衡，引起脂肪堆積，導(dǎo)致肥胖，由此導(dǎo)致發(fā)生癌癥、心血管疾病、糖尿病及其他慢性疾病的風(fēng)險大大增加。而做為細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的核心細(xì)胞器，線粒體數(shù)量的減少和氧化代謝活性的降低，勢必影響到脂肪酸的消耗以及脂肪的分解。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠及人類脂肪組織中mtDNA 拷貝數(shù)顯著降低，線粒體基因表達(dá)水平顯著減少；胰島素抵抗者的線粒體數(shù)量顯著降低，功能顯著下降［10］；長期大量的ROS生成會改變肝臟和骨骼肌線粒體數(shù)量以及動態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，產(chǎn)生脂質(zhì)積聚和胰島素抵抗［11］。在激光共聚焦顯微鏡下，肥胖成人的脂肪細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示肥胖者脂肪細(xì)胞熒光值明顯降低，線粒體含量降低［12］。研究表明，過氧化物增殖體活化受體（PPARγ）激活劑不但使胰島素抵抗得到改善，還能使脂肪細(xì)胞的分化及功能得到改善，增加脂肪細(xì)胞線粒體的生物合成，提高線粒體的活性［13］。db／db小鼠脂肪細(xì)胞線粒體蛋白、氧化磷酸化合酶的表達(dá)水平均顯著下降，線粒體數(shù)量顯著降低；ob／ob小鼠脂肪細(xì)胞線粒體不僅數(shù)量顯著減少，且比正常小鼠要小得多，存在線粒體功能障礙［14］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器，通過糖酵解和磷酸化作用都可以產(chǎn)生ATP，因此，ATP 是反映線粒體狀態(tài)及活性的指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肥胖組大鼠脂肪細(xì)胞的線粒體含量、ATP 含量、細(xì)胞色素氧化酶（COX）活性都顯著降低；有氧代謝相關(guān)基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表達(dá)水平顯著降低，表明肥胖大鼠脂肪細(xì)胞的線粒體含量減少，氧化呼吸活性減弱，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

3.3 運(yùn)動與線粒體

線粒體是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，細(xì)胞有超過95%的能量都來源于線粒體的氧化呼吸作用［15］。隨著細(xì)胞狀態(tài)（增殖分化）以及周圍環(huán)境（運(yùn)動、寒冷）的變化，為適應(yīng)不同狀態(tài)的能量需求，線粒體的數(shù)量也會發(fā)生改變［16］。而有關(guān)運(yùn)動對線粒體影響的研究主要集中在不同運(yùn)動方式后骨骼肌線粒體的變化。研究表明，有氧運(yùn)動可使骨骼肌線粒體數(shù)量增加，體積和呼吸功能增大增強(qiáng)［17］；長時間耐力運(yùn)動可使人體骨外側(cè)肌mfn1／2基因表達(dá)顯著增加，線粒體數(shù)量以及氧化磷酸化能力增加；12周游泳運(yùn)動使大鼠腓腸肌線粒體態(tài)3呼吸顯著升高，Mfn2基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高，線粒體含量增加，線粒體有氧代謝能力升高［18］。習(xí)慣久坐的肥胖成年人經(jīng)過減體重和體育鍛煉干預(yù)后，骨骼肌線粒體數(shù)量增加，橫斷面面積上升，占肌纖維體積百分比增加，體積擴(kuò)大［4］。短時間大強(qiáng)度的速度和力量項目的運(yùn)動訓(xùn)練對骨骼肌線粒體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能的影響不甚明顯。另有研究報道，12 周跑臺訓(xùn)練能夠增強(qiáng)非酒精性脂肪肝小鼠肝細(xì)胞線粒體的ATP合成，態(tài)3呼吸升高，改善線粒體的功能［19］。有關(guān)運(yùn)動對脂肪細(xì)胞線粒體的影響鮮見報道。

3.4 有氧運(yùn)動、肥胖與脂肪細(xì)胞線粒體

動物實驗發(fā)現(xiàn)，長期有氧運(yùn)動可使肥胖大鼠機(jī)體消耗能量增加，體脂減少，可以有效降低肥胖大鼠的體重［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動干預(yù)組大鼠較肥胖組大鼠體重顯著降低，與前人研究結(jié)果一致。

研究表明，運(yùn)動訓(xùn)練可以使線粒體體積增大，氧化酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體氧化呼吸活性的改變，增加運(yùn)動過程中脂肪酸的氧化水平。耐力訓(xùn)練還可引起線粒體適應(yīng)，使其脂肪酸氧化能力提高，并伴隨線粒體中軟脂酸氧化率及檸檬酸合成酶活性的提高［21］。有氧運(yùn)動被廣泛認(rèn)為是一種合理有效的預(yù)肥減肥手段之一，而脂肪細(xì)胞線粒體是脂肪酸β氧化的主要場所之一，是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的核心細(xì)胞器，那么，有氧運(yùn)動是否通過影響脂肪細(xì)胞線粒體的含量及活性，從而達(dá)到健康減脂的效果，鮮見研究報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周游泳運(yùn)動后，運(yùn)動組大鼠脂肪組織中線粒體含量、ATP含量、細(xì)胞色素氧化酶（COX）活性都顯著升高；有氧代謝相關(guān)基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表達(dá)水平顯著升高。表明運(yùn)動干預(yù)使肥胖大鼠脂肪細(xì)胞線粒體的含量、活性增加，氧化呼吸功能增強(qiáng)。

4 小結(jié)

肥胖大鼠脂肪細(xì)胞線粒體的數(shù)量、活性及氧化呼吸功能顯著下降，肥胖大鼠存在脂肪細(xì)胞線粒體功能障礙；有氧運(yùn)動干預(yù)可使肥胖大鼠脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)量／活性、氧化呼吸功能增強(qiáng)；有氧運(yùn)動可能通過提高脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)量、活性、氧化呼吸功能而達(dá)到減輕體重的作用，是有氧運(yùn)動控制體重與健康減脂的機(jī)制之一。

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