青海極端生境植物根圍促生菌分離鑒定及生物活性分析

吳曉暉 謝永麗 梁欣 張英 蘆光新

摘要：通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)以分離篩選自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)3個(gè)極端生境植被根圍的菌株為供試菌株，進(jìn)行拮抗活性檢測(cè)；采用16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株；采用CMC法及Gram染色法測(cè)定菌株降解纖維素活性；對(duì)具降解纖維素活性的拮抗菌株進(jìn)行促生活性測(cè)定。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5分別對(duì)油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麥長(zhǎng)孢蠕菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）具有拮抗活性，抑菌圈平均直徑均>20 mm。3株菌株均被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均具降解纖維素及促植物生長(zhǎng)活性。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；分子鑒定；降解纖維素活性；拮抗活性；促生

中圖分類號(hào)：Q948.12+2.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）08-0061-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.016

Isolation and Identification of Growth-promoting Rhizosphere Strains Isolated from Extreme Environment and Its Biological Activity Analysis

WU Xiao-hui，XIE Yong-li，LIANG Xin，ZHANG Ying，LU Guang-xin

（College of Agricultural and Animal Husbandry，Qinghai University/Key Laboratory of Altiplano Grassland Resource and Ecology，Province and Education Ministry，Xining 810016，China）

Abstract： The strains were isolated from three representative extreme sample area including Tuogeruoge semi-desert sand，Tuosu Lake salt and alkali land，detonation test site of Haibei in Qinghai province. Antagonistic activity detection was used to check antagonistic activity of these strains. Polyphasic molecular taxonomy methods including gyrB and 16S rDNA partial sequence analysis were used to identify these strains. The CMC plate test and Gram staining method were used to analysis cellulose degradation of the bio-control strains. The results showed that three strains including TGRG3，TGRG7 and TSH5 could present distinct antagonistic activity to Sclerotinia sclerotiorum，F(xiàn)usarium graminearum and Helminthotporium tritici-vulgaris，and diameters of the inhibition zone were all longer than 20 mm. The strains of TGRG3，TGRG7 and TSH5 were identified as Bacillus subtilis. All of three biocontrol B. subtilis strains had cellulose-degradation activity and promotion function on growth of plant.

Key words： Bacillus subtilis； molecular identification； cellulose-degradation activity； antagonistic activity； growth-promoting

芽孢桿菌（Bacillus spp.）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧，能產(chǎn)生耐熱、耐鹽堿、耐紫外等內(nèi)源芽孢，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，分布于各種環(huán)境中，在農(nóng)牧業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究等方面扮演著極其重要的角色[1]。芽孢桿菌作為根圍促生菌（Plant Growth-promoting Rhizobacteria，PGPR），其促生機(jī)制包括提高植物根際營(yíng)養(yǎng)的可利用性，促進(jìn)難溶性磷、鐵和微量元素的吸收；產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)有赤霉素（Gibberellins）、吲哚-3-乙酸（IAA）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin）等。此外，還可通過(guò)抑制病原物、誘導(dǎo)植物抗病性來(lái)間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]。部分芽孢桿菌能夠固氮、溶磷，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分解，從而提高土壤肥力，促進(jìn)土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)；部分芽孢桿菌能產(chǎn)生胞外纖維素酶、半纖維素酶等，能夠有效降解木質(zhì)纖維素[3，4]。芽孢桿菌是當(dāng)前研究應(yīng)用較廣的一類微生物資源。

草場(chǎng)是以土壤-牧草-家畜為主體形成的生態(tài)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，微生物對(duì)土壤、牧草和家畜都起著至關(guān)重要的作用[5]。青海省地域環(huán)境特殊，秋冬季節(jié)草場(chǎng)枯黃，飼料來(lái)源緊張，若將能產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素酶類的生防芽孢桿菌菌源應(yīng)用于飼料加工生產(chǎn)，通過(guò)芽孢桿菌分泌的高效纖維素降解酶加速草料降解，使草料養(yǎng)分有效釋放，提高牲畜對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收效率，是畜牧業(yè)發(fā)展的有效途徑[6]。

青海省為“三江之源”，是重要的農(nóng)牧業(yè)大省，特殊生境決定其生態(tài)環(huán)境保護(hù)的差異性。因此，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，可降低其對(duì)人類健康、生態(tài)環(huán)境及糧食安全構(gòu)成的嚴(yán)重威脅，而開(kāi)發(fā)綠色天然、對(duì)環(huán)境友好的生物菌肥應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境保護(hù)、植被退化恢復(fù)，顯得尤為重要[6]。芽孢桿菌抗菌防病機(jī)制主要包括拮抗與競(jìng)爭(zhēng)作用、誘導(dǎo)植物抗病性。生防細(xì)菌最主要的抗菌機(jī)制是核糖體合成的細(xì)菌素、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等抗菌蛋白以及次生代謝產(chǎn)生的抗生素與揮發(fā)性抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的拮抗作用。芽孢桿菌抑制植物病原菌的范疇很廣，包括根、莖、葉、花及果實(shí)病害，使其在植物病害生物防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[7]。芽孢桿菌對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人畜安全，是理想的生防菌篩選菌源，也是理想的生物農(nóng)藥和生物菌肥的研發(fā)菌源，對(duì)生態(tài)農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展有重要意義。

以分離自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)極端生境的植物根圍菌為供試菌株，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定菌株拮抗活性；16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株；CMC平板法和Gram染色法測(cè)定菌株降解纖維素的能力，測(cè)定供試菌株促植物生長(zhǎng)活性，為青藏高原農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及飼料加工產(chǎn)業(yè)提供了適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境的可利用菌源。因此，探究草地生態(tài)系統(tǒng)中微生物功能，合理發(fā)掘利用微生物資源，對(duì)草地生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芽孢桿菌菌株分離自青海托格若格半荒漠沙地駱駝蓬（Peganum L.）根圍、托素湖鹽堿地帶野生黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr）根圍、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)高山嵩草草甸（Kobresia pygmaea）根圍；病原指示菌油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum de Bary）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麥長(zhǎng)蠕孢菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）由青海大學(xué)高原草地資源與生態(tài)省部共建實(shí)驗(yàn)室保存；小麥（Triticum aestivum Linn）種子（高原448號(hào)）由青海省農(nóng)林科學(xué)院饋贈(zèng)。

細(xì)菌培養(yǎng)LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基、CMC-Na培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[8]配制。

引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑dNTP Mixture（CD117）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；基因組序列測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集及菌株分離 土樣采自青海托格若格半荒漠沙地駱駝蓬根圍、托素湖鹽堿地帶野生黑枸杞根圍、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)高山嵩草草甸根圍。采用五點(diǎn)取樣法，用小鏟除去表土，取植物根部5～25 mm處土樣，裝入采樣袋內(nèi)，標(biāo)記好采樣植被、時(shí)間、地點(diǎn)等[9]。菌株分離采用平板稀釋法，稱取5 g土樣，將土壤研磨成粉末狀，放入45 mL生理鹽水中，搖床振蕩30 min，靜置使之澄清；用無(wú)菌水將其稀釋為10-1、10-2、10-3 3個(gè)濃度梯度，將稀釋液80 ℃金屬浴10 min后取出。吸取各濃度稀釋液200 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基平板中，倒置于恒溫箱中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落于新LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)；挑取形態(tài)不同的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，用平板劃線分離法純化，直至獲得純培養(yǎng)[9]。

1.2.2 拮抗病原真菌活性測(cè)定 分別將26 ℃培養(yǎng)箱中活化后的油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長(zhǎng)孢蠕菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7 cm的菌碟， 接種在新PDA平板中央。在距離菌塊2.5 cm處3個(gè)接種點(diǎn)上放置直徑為4 mm的濾紙小圓片，吸取5 μL 37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)14 h的芽孢桿菌菌液，接種于濾紙片上，每個(gè)處理重復(fù)3次，放入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，取出觀測(cè)并記錄抑菌結(jié)果[10]。

1.2.3 菌株分子鑒定 通過(guò)16S rDNA基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA基因，正向引物127F：5′-AGAGTTTGATCMTG

GCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GCYTACCTTGTT

ACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)[11]。

通過(guò)gyrB基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增gyrB基因，正向引物gyrB-For：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3′，反向引物gyrB-Rev：5′-AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGT CAT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)[12]。

1.2.4 菌株降解纖維素活性測(cè)定 在CMC篩選培養(yǎng)基平板上設(shè)置3個(gè)接種點(diǎn)，放置直徑為4 mm的濾紙小圓片。將供試菌株在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液5 μL于濾紙片中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，將革蘭氏碘染液（Gram iodime）注入并淹沒(méi)平板表面，蓋上平皿蓋，靜置4 min后，倒去染液，觀測(cè)并記錄結(jié)果。測(cè)定并記錄透明圈直徑、菌落直徑，并計(jì)算兩者比值A(chǔ)[13]。

1.2.5 菌株促生活性測(cè)定 選擇種皮完好的小麥種子（高原448號(hào)）在20%次氯酸鈉溶液中消毒處理20 min，無(wú)菌水沖洗3～4次；將種子在菌懸液中浸種24 h（菌懸液稀釋濃度106 CFU/mL），無(wú)菌水處理作對(duì)照；將浸種后的種子播于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，光周期16 h/8 h），培養(yǎng)5 d后觀察種子的萌發(fā)情況，測(cè)定芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮重，統(tǒng)計(jì)芽孢桿菌對(duì)植物的催芽效果；每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)選50粒種子進(jìn)行測(cè)定和記錄[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌分離

在菌株分離過(guò)程中，土壤稀釋液經(jīng)80 ℃金屬浴10 min，普通細(xì)菌被滅活，而芽孢桿菌為適應(yīng)高熱環(huán)境而形成孢子，通過(guò)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)初步分離得到。從青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)共分離到500余株菌株，根據(jù)不同的菌落形態(tài)，分別從托格若格樣點(diǎn)選擇10株菌株，托素湖樣點(diǎn)選擇10株單菌落，海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)樣點(diǎn)選擇6株細(xì)菌單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)（圖1）。

2.2 拮抗病原真菌活性

將分離的16株菌株多次轉(zhuǎn)接，選擇其中活性強(qiáng)的7株作為供試菌株，分別命名為BHC1、BHC4、BHC5、TGRG3、TGRG7、TSH5、TSH6。以油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長(zhǎng)孢蠕菌為病原真菌指示菌，檢測(cè)菌株拮抗病原真菌活性。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5對(duì)3種病原真菌均具有明顯的拮抗病原真菌活性，抑菌圈直徑>20 mm（表1）。

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 16S rDNA序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA基因片段，擴(kuò)增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶（圖2）。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI中，用BLAST軟件與GenBank中己知序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5與芽孢桿菌B. subtilis ATCC49760（登錄號(hào)：CP014840.1）的16S rDNA序列同源性皆為99%。

2.3.2 gyrB基因序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因組DNA為模板擴(kuò)增gyrB基因片段，擴(kuò)增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶（圖2）。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI中，用BLAST軟件與GenBank中己知序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5與枯草芽孢桿菌B. subtilis ATCC49760（登錄號(hào)：CP014840.1）的gyrB基因序列同源性分別為97%、96%、98%（表2）。

2.4 降解纖維素活性

以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5作為供試菌株，檢測(cè)菌株降解纖維素活性。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纖維素為惟一碳源的CMC-Na培養(yǎng)基上，分別形成直徑為13.0、14.3、14.3 mm的降解透明圈，D/d（透明圈直徑D與菌落直徑d之比）分別為2.06、2.04、1.96，表現(xiàn)出降解纖維素活性。菌株降解纖維素的活性A與D/d呈正相關(guān)，即D/d越大，菌株降解纖維素活性越強(qiáng)（圖3、表3）。

2.5 菌株促生效果測(cè)定

將菌株TGRG3、TGRG7、TSH5發(fā)酵液分別制備成細(xì)胞濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，對(duì)小麥進(jìn)行浸種處理，以無(wú)菌水浸種作為對(duì)照，播種培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)小麥幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及鮮重。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后的小麥芽長(zhǎng)與對(duì)照組相比分別增長(zhǎng)6.50%、1.45%、2.89%。菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后小麥根長(zhǎng)較對(duì)照分別增長(zhǎng)33.49%、3.52%、12.05%；菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后小麥鮮重較對(duì)照分別增加30.00%、15.31%、23.05%。其中，菌株TGRG3菌懸液對(duì)根長(zhǎng)的促生效果尤為顯著（表4）。

3 討論

青藏高原強(qiáng)烈的地形變化、獨(dú)特的大氣環(huán)流和氣候的多樣性，提供了多樣性的生物棲息環(huán)境，為極端微生物資源的研究開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供了平臺(tái)[14]。本研究以分離篩選自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地帶、海北爆轟試驗(yàn)場(chǎng)3個(gè)極端生境植物根圍菌為供試菌株，以油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長(zhǎng)孢蠕菌為病原指示菌，測(cè)定供試菌株的拮抗活性。結(jié)果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5對(duì)3種病原真菌均具有明顯拮抗活性，抑菌圈直徑均大于20 mm。

16S rDNA和gyrB基因常被用于細(xì)菌鑒定，利用核糖體16S rDNA基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，此引物能與多數(shù)種屬的核糖靶位點(diǎn)結(jié)合[11]；gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基，使gyrB基因序列在區(qū)分鑒定細(xì)菌近緣種方面較非蛋白編碼基因16S rDNA更精確[12]。本研究對(duì)菌株TGRG3、TGRG7、TSH5進(jìn)行16S rDNA及gyrB基因序列分子鑒定，綜合兩種鑒定結(jié)果，3株菌株均被鑒定為枯草芽孢桿菌。對(duì)菌株TGRG3、TGRG7、TSH5進(jìn)行促生效果測(cè)定，與對(duì)照相比，3株菌株對(duì)高原小麥品種的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮重均有不同程度的促生效果，其中菌株TGRG3對(duì)根長(zhǎng)的促生效果最為顯著。3株菌株分離篩選自高原極端生境，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高地上生物量，在高原植被恢復(fù)、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展方面具有一定的應(yīng)用潛力[15]。CMC平板及Gram染色法檢測(cè)菌株降解纖維素活性，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纖維素為惟一碳源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，表明菌株可產(chǎn)生纖維素降解酶，表現(xiàn)出明顯的纖維素降解活性。在飼料加工生產(chǎn)及作物秸稈還田中，若利用生防菌株分泌產(chǎn)生的纖維素降解酶來(lái)加速草料或秸稈木質(zhì)纖維素的降解，可使飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解為容易被牲畜吸收利用的單糖、寡糖成分，使養(yǎng)分得到更有效的釋放[16]，對(duì)飼料加工生產(chǎn)、農(nóng)田土壤結(jié)構(gòu)和肥力的改善都有重要意義[17]。

本研究分離篩選自青海極端生境的枯草芽孢桿菌菌株適應(yīng)高原特殊生境，兼具拮抗活性、降解纖維素活性及促生活性，可作為生物菌肥和生物農(nóng)藥的研發(fā)菌源，并可作為飼料加工生產(chǎn)中改善飼料木質(zhì)纖維素降解的有益菌源，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)及飼料加工中具有一定的研究及應(yīng)用潛力。

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