肉毒桿菌B誘導(dǎo)大鼠干眼模型中淚腺Lacritin蛋白表達(dá)的研究△

高偉 程燕 吳潔 王亮 趙帥

隨著人民生活環(huán)境的不斷改變，干眼癥的發(fā)病率不斷增加，并有年輕化的傾向。有研究表明［1］，55歲以上的人群中干眼癥發(fā)病率高達(dá)10%～20%。引起干眼癥的病因很多，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。近年來，對于干眼癥的研究也逐漸增多，動物模型的建立對干眼癥的研究起到重要的基礎(chǔ)作用，而炎癥模型的建立更為重要。我們利用肉毒桿菌B誘導(dǎo)大鼠建立干眼炎癥模型，通過觀察Lacritin蛋白表達(dá)變化為干眼癥的診治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 30只(30眼)健康8周雌性 SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組20只，對照組10只。實(shí)驗(yàn)組右側(cè)淚腺注射肉毒桿菌B，對照組右側(cè)淚腺注射生理鹽水。肉毒桿菌B(美國Elan公司)，淚液檢測濾紙條(天津晶明新技術(shù)發(fā)展有限公司)，抗大鼠腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，羊抗大鼠IL-6單克隆抗體(美國PeproTech公司)，抗鼠Lacritin蛋白抗體(美國Sant Cruz公司)。裂隙燈顯微鏡(SL-1E，日本 Topcon公司)，熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 實(shí)驗(yàn)組20只大鼠腹腔注射100 g·L－1水合氯醛(4 mL·kg－1)，待動物麻醉后在手術(shù)顯微鏡下暴露淚腺，將大鼠的右側(cè)淚腺注射肉毒桿菌B 0.1 mL(20 mU)，對照組同樣方法注射生理鹽水 0.1 mL。

1.2.2 淚液分泌試驗(yàn)檢查 分別于術(shù)前1 d及術(shù)后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d，將大鼠基礎(chǔ)麻醉后檢測淚液的分泌，將淚液檢測濾紙條置于下瞼中外1/3處，5 min后測量變色長度。

1.2.3 熒光素鈉染色檢查 分別于術(shù)前1 d及術(shù)后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d，使用 10 g·L－1熒光素鈉溶液染色，1 min后觀察角膜熒光染色并在裂隙燈顯微鏡下拍照。角膜熒光染色評分采用 Park計分方法［2］:0分:無著色點(diǎn);1分:點(diǎn)狀著色≤1/8象限;2分:1/8象限 ＜點(diǎn)狀著色≤1/4象限;3分:1/4象限＜點(diǎn)狀著色≤1/2象限;4分:點(diǎn)狀著色 ＞1/2象限。

1.2.4 免疫熒光化學(xué)染色方法 分別于術(shù)后3 d、7 d、28 d、42 d隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)鼠脊髓離斷處死，立即取其淚腺放入40 g·L－1多聚甲醛液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片并染色，分步遞加一抗 Lacritin(Santa Cruz，兔)工作濃度為1∶50，二抗為生物素標(biāo)記的兔IgG(美國Vector公司)1∶200，室溫孵育1 h，ABC復(fù)合物(美國Vector公司)臨用前1 h按說明書配制，室溫孵育1 h，然后DAB顯色(顯色盒購自北京中杉生物公司)。然后脫水、透明并用中性樹膠封片。免疫熒光化學(xué)染色一抗?jié)舛?、時間同上，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗(北京中杉生物公司)工作濃度為1∶200，室溫避光孵育2 h，封片前加入DAPI。在BX51熒光顯微鏡下對目標(biāo)部位進(jìn)行照相，用于定性觀察Lacritin蛋白表達(dá)。免疫熒光化學(xué)染色一抗?jié)舛取r間同上，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗(北京中杉生物公司)工作濃度為1∶200，室溫避光孵育2 h，封片前加DAPI。

1.2.5 Western blot檢測方法 大鼠麻醉后，在冰上快速切取淚腺組織，加入適量裂解液，眼科剪將組織剪碎，然后用組織機(jī)械粉碎儀將組織研碎，再用超聲破碎儀使組織充分粉碎(72 kJ，20%振幅，超聲5 s，間歇 25 s，共 5 min，冰浴中進(jìn)行)。然后 4 ℃、12 000 r·min－1離心 10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一個預(yù)冷的Eppendorf管中－80℃保存。提取的組織勻漿上清用Bradford法進(jìn)行蛋白定量;取15 μg樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液混勻，100℃沸水煮沸2 min;用120 g·L－1聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下用封閉液作用1 h后加入Lacritin一抗(1∶2000，Santa Cruz)，4℃過夜，洗滌3次 ×10 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000稀釋，北京中杉生物公司)孵育2 h，洗滌3次×10 min;用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，感光在膠片上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin(1∶2000，Santa Cruz)作內(nèi)參照，用英國SYNGENE公司的GeneTools軟件對采集的Western blot檢測結(jié)果進(jìn)行分析，分析條帶的變化趨勢，檢測術(shù)前、術(shù)后3 d、7 d、28 d、42 d 淚腺組織 Lacritin 蛋白含量變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淚液分泌試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組從術(shù)后3 d時出現(xiàn)淚液分泌減少，實(shí)驗(yàn)組為(2.56±0.72)mm，對照組為(3.04±0.72)mm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.391);術(shù)后7 d、14 d、28 d 2組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表1);在28 d時實(shí)驗(yàn)組淚液分泌減少達(dá)到最低;42 d時淚液分泌恢復(fù)，與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組從3 d開始持續(xù)到28 d與術(shù)前1 d比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P＜0.05)。對照組術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為 P ＞0.05)。

表1 2組淚液分泌結(jié)果Table 1 Results of Schirmer I test in two groups(l/mm)

2.2 熒光素鈉染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 d角膜開始出現(xiàn)熒光素鈉著色，逐漸增多;至7 d上皮缺損逐漸融合呈片狀;在術(shù)后28 d著色最重，之后角膜上皮染色范圍未繼續(xù)擴(kuò)大且逐漸縮小;但一直到42 d時仍未恢復(fù)，即使這時淚液分泌已經(jīng)恢復(fù)正常。對照組角膜光亮，無上皮損傷，除術(shù)前1 d和術(shù)后3 d外，余時間點(diǎn)2組評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05，見表2)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時間點(diǎn)角膜熒光染色評分與術(shù)前1 d比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P ＜0.05)。

表2 2組角膜熒光染色評分Table 2 Corneal fluorescein staining scores in two groups (Score)

2.3 免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果 在淚腺腺泡細(xì)胞的胞漿內(nèi)可以看到Lacritin蛋白的表達(dá)，呈綠色熒光染色，藍(lán)色為腺泡細(xì)胞核，腺泡細(xì)胞周圍以及結(jié)締組織周圍沒有發(fā)現(xiàn)其分布(圖1)。

Figure 1 Expression of Lacritin protein in cytoplasm of lacrimal gland alveolus(green fluorescence) 淚腺腺泡細(xì)胞漿中Lacritin蛋白表達(dá)(綠色熒光)

2.4 Western blot檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組淚腺組織Lacritin蛋白含量檢測顯示:術(shù)前差異不明顯，術(shù)后3 d開始減少，7 d達(dá)到最低，28 d時含量仍呈低表達(dá)，42 d開始恢復(fù)。對照組Lacritin蛋白含量各時間點(diǎn)未出現(xiàn)變化(圖2-圖3)。

Figure 2 Lacritin protein electrophoresis images.A:Experimental group，B:Control group Lacritin蛋白電泳圖。A:實(shí)驗(yàn)組，B:對照組

Figure 3 Western blot results of Lacritin protein expression at different time points of two groups 實(shí)驗(yàn)組與對照組各時間點(diǎn)淚腺組織Lacritin蛋白Western blot檢測結(jié)果

3 討論

隨著生存環(huán)境變化和用眼習(xí)慣的變化，干眼癥的發(fā)病率不斷增加，并有年輕化的傾向，因此這個在過去常常被忽視的眼科疾病，也越來越受到人們的重視，它已經(jīng)成為發(fā)病率最高的眼表疾病之一。

引起干眼癥的病因很多，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。但是盡管引起干眼癥的起始病因不同，一旦進(jìn)入進(jìn)展階段，炎癥就成為干眼癥發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵的因素，T淋巴細(xì)胞浸潤的淚腺分泌的淚液中含有炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，可介導(dǎo)形成持續(xù)的炎癥。而細(xì)胞凋亡、神經(jīng)調(diào)節(jié)及性激素等也共同參與了干眼癥的發(fā)病過程［3-4］，因此，不同類型的干眼癥表現(xiàn)出相似的病理生理改變，所以建立一個干眼癥的炎癥動物模型為干眼癥的研究創(chuàng)造了一個重要基礎(chǔ)。

Zhu等［5］通過實(shí)驗(yàn)建立了一種動物炎癥模型，他們將兔一側(cè)淚腺摘除，通過對上皮細(xì)胞的培養(yǎng)增殖獲得自體外周淋巴細(xì)胞注射到對側(cè)淚腺制造干燥綜合征兔眼模型。組織病理圖片顯示與干燥綜合征患者相似，可以看到淚腺組織主要為CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤，同時淚液產(chǎn)生的減少和角膜熒光染色均與干燥綜合征患者相同。Lin等［6］將 Lewis鼠的一側(cè)淚腺摘出勻漿，對勻漿的淚腺組織加入滅活的百日咳桿菌，進(jìn)行進(jìn)一步處理，然后回注入對側(cè)淚腺，可增強(qiáng)其抗原性，誘導(dǎo)更嚴(yán)重的淚腺和唾液腺自身免疫反應(yīng)，制成干眼癥炎癥模型，但都存在著創(chuàng)傷大、不良反應(yīng)及維持時間短的缺點(diǎn)。

而我們通過對大鼠淚腺中注射肉毒桿菌B，在神經(jīng)肌肉接頭處抑制乙酰膽堿的釋放而阻斷膽堿能神經(jīng)活動傳遞，達(dá)到減少淚液分泌的作用。結(jié)果顯示:淚液分泌在實(shí)驗(yàn)組注射后3 d開始出現(xiàn)減少，28 d達(dá)到最低，角膜上皮缺損持續(xù)出現(xiàn)42 d，未出現(xiàn)其他眼部和全身的副作用。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)淚腺注射肉毒桿菌B可成功建立大鼠干眼癥炎癥模型，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、損傷小、耗時短(3 d)、維持時間長(1個月)、干眼癥體征明顯。前期的實(shí)驗(yàn)病理檢測可見眼表炎癥反應(yīng)明顯，分析可能是肉毒桿菌B損害了淚腺及其神經(jīng)的正常功能，致使淚液分泌量下降，引起CD4+T淋巴細(xì)胞等炎癥因子的產(chǎn)生，誘發(fā)眼表炎癥反應(yīng)，造成惡性循環(huán)。組織切片顯示:注射肉毒桿菌B后淚腺組織沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，這也就區(qū)別其他先造成淚腺炎癥而后出現(xiàn)干眼的動物模型，為那些非干燥綜合征的常見的干眼癥患者提供了很好的動物模型。Zhu等［5］給大鼠淚腺注射肉毒桿菌B后4周發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子在淚液以及眼表組織中表達(dá)明顯升高，表明其方法可以建立一種更接近人類的慢性假性免疫干眼癥大鼠模型［7］。

人們在淚液中發(fā)現(xiàn)大約有400種蛋白，但是參與眼表疾病的蛋白不超過5%，而Lacritin蛋白是目前發(fā)現(xiàn)唯一促進(jìn)淚液分泌功能的蛋白［8］。近年來，人們通過對其結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，逐漸發(fā)現(xiàn)其作為一種類生長因素蛋白，在干眼癥的發(fā)生和發(fā)展中都起到重要作用［9-10］，但是具體的作用機(jī)理尚未完全明了，已經(jīng)是現(xiàn)在研究干眼癥的一個重要方向。Lacritin蛋白主要由淚腺分泌，經(jīng)過腺管分泌到眼表面。前期的臨床研究表明有促進(jìn)有絲分裂、角膜上皮細(xì)胞增殖和淚液分泌的作用。當(dāng)出現(xiàn)干眼時，其在淚液、眼表的表達(dá)減低［11］。Samudre 等［12］用人重組體Lacritin蛋白對兔干眼模型動物滴眼，14 d后發(fā)現(xiàn)其可以增加淚液基礎(chǔ)分泌量50%。目前，對Lacritin蛋白的研究為干眼疾病的病理研究和治療提供了一個重要思路。

本研究結(jié)果顯示:Lacritin蛋白的表達(dá)在淚腺腺泡細(xì)胞中，從注射3 d后出現(xiàn)表達(dá)減低，一直持續(xù)6周，與淚液的分泌減少和眼表損害呈同步變化，從而間接地證實(shí)Lacritin蛋白在干眼癥引起的臨床癥狀中不可或缺，同時病理切片還發(fā)現(xiàn)淚腺組織結(jié)構(gòu)仍然保持良好，未發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞浸潤，說明淚腺腺泡細(xì)胞分泌的Lacritin蛋白主要隨淚液分泌到眼表發(fā)揮作用。由于Lacritin蛋白主要是淚腺分泌的，而瞼板腺和結(jié)膜分泌可以忽略不計，所以檢測淚液或結(jié)膜組織中的含量可以作為定量觀察淚腺分泌功能的一個客觀指標(biāo)，為觀察治療干眼癥的藥物療效以及并發(fā)癥的轉(zhuǎn)歸提供了一個重要量化指標(biāo)。當(dāng)然，Lacritin蛋白與炎癥因子的關(guān)系及其功能和作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，淚腺注射肉毒桿菌B可以誘導(dǎo)大鼠建立一種干眼癥炎癥模型，而Lacritin蛋白的檢測可以為以后干眼癥的轉(zhuǎn)歸以及觀察藥物療效提供了一個新的量化標(biāo)準(zhǔn)。

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